155873. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított amiloglukozidáz-készítmények előállítására

155873 szintre állítjuk, amelynél az enzim stabilitása a legnagyobb; ez általában 3 és 6, előnyösen 4,0 és 4,5 pH-érték között lehet. Az így kapott enzimkészítmények igen nagy termelési hányadot biztosítanak a keményítő szokásos módon glukózzá történő lebontása során, 98—98,5% D. U. értékkel. A találmány szerinti inkubáció, 2,4 körüli pH-nérték mellett, már az amiloglukozidáz előállítása céljából lefolytatott fermentáció utolsó szakaszában, pl. a fermentáció utolsó három órájában lefolytatásra kerülhet, a fermentáció szokásos körülményeihez a lehető legnagyobb mértékben adaptált körülmények között; ez az eljárásmód gyakorlati szempontból igen előnyös lehet. Az amiloglukozidáz-aktivitás meghatározása. Az amiloglukozidáz-aktivitás szokásos meghatározási módszerei azon alapulnak, hogy az amiloglukozidáz oldható keményítőre történő hatása során felszabaduló glukóz mennyiségét határozzák meg. Az alább leírt eljárás esetében Somogyi és Nelson módszerét alkalmazzuk a felszabaduló glukóz mennyiségének meghatározására (ezt a módszert a J. Biol. Chem. 195, 19, 1952 közleménye ismerteti). Az international Union of Biochemistry ajánlásának megfelelően az amiloglukozidáz-iaktivitás egységnek azt az enzim-mennyiséget tekintjük, amely a keményítőből az adott meghatározási körülmények között, a jelen esetben 4,5 pH-értéken és 40' C° hőmérsékleten 1 perc alatt 1 mikromól glukózt képez. A meghatározás céljára 0,8 ml 0,05 mólos nátriumaeetát-puffert (pH — 4,5) 1,0 ml 0,1%os koncentrációjú oldható keményítő oldattal elegyítünk. Az elegy hőmérsékletét termosztátban 40,0±0,1 C°-ra szabályozzuk be. Ezután hozzáadunk 0,2 ml oly enzim-oldatot, amely 0,025—0,25 E/ml enzim-aktivitást tartalmaz. Pontosan 15 perc múlva az inkubációt megszakítjuk 2,0 ml Somogyi-reagens hozzáadása útján. Ezután a reakcióéi egyet forrásban levő vízfürdőben pontosan 10 percig hevítjük. Lehűlés után 2,0 ml Nelson-reagenst adunk hozzá, majd összekeverés után mérjük a kapott oldat ixtinkcióját. A vak-meghatározást oly módon végezzük, hogy előbb adjuk hozzá a Somogyireagenst, majd ezután a 0,2 mm enzim-oldatot. A kapott értéket azután egy standard glukózoldattal hasonló módon végzett meghatározás útján kapott értékkel hasonlítjuk össze. Az enzim-aktivitást az alábbi képlet segítségével számítjuk ki: n-Ec 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 65 Aktivitás = 540 E„ ahol Eg a glukóz • standard-oldat extinkcióját, levonva belőle a vak-meghatározás során kapott értéket, .520 millimikronnál, 65 Ee

az enzim-meghatározás extinkcióját, levonva belőle a vak-meghatározás során kapott értéket, 520 miliimikronnál, n meg glukóz 0,2 ml standard glukóz-oldatban. A transzglukozidáz-aktivitás meghatározása. Ez a meghatározás az izomaltóznak és panóznak maltózból transzglukozidáz hatására történő képződésén alapul. A maltóz koncentrációja 5%; ezt oly módon választottuk meg, hogy a jelenlevő amiloglukozidáz hatására képződött glukózból történő izomaltóz-képződés ne befolyásolja észrevehetően a meghatározás eredményét. 10 ml 0,05 mólos, 4,5 pH-értékű nátriumacetát-jpufferoldattal készített 5%,-os maltózoldathoz 80 C° hőmérsékleten kb. 12,5 egységnek megfelelő amiloglukozidáz oldatot adunk, amely tramszglukozidázt is tartalmaz. A reakcióelegyet 2,5 óra hosszat inkubáljuk 60 C° hőmérsékleten. A reakció leállítása céljából azután 2 ml 30%-os triklórecetsavoldatot adunk a reakcióelegyhez, majd a reakcióelegy 10 mikröliternyi mennyiségét papírkromatográfiás szétválasztásnak vetjük alá n-butanol — piridin — -víz 6:4:3 arányú elegyét alkalmazva futtató folyadékként. A képződött kromatogramm megszárítása után a cükorfoltokat valamely érzékeny reagens segítségével tesszük láthatókká. Erre a célra igen alkalmas az olyan acetonos ezüstnitrát oldat, amely 1 ml telített ezüstnitrát-oldatot tartalmaz 200 ml acetonban, majd annyi desztillált vízzel van feltöltve, amennyi a képződött csapadék teljes oldásához szükséges. A reagensbe mártott fcromatogrammot megszárítjuk, majd 0,5 n metanolos alkálioldatba mártjuk és utána forrásban levő víz gőzében tartjuk 1 percig. A reagens feleslegét oly módon távolítjuk el, hogy a kromatogrammot 20 percig mossuk, 10%-os nátriumtioszulfát-oldattal. Végül a kromatogrammot vízzel 1 óra hosszat öblítjük. Ezután a transzglukozidáz-aktivitást oly módon határozhatjuk meg, hogy a kromatogrammon denzitometriás módszerrel mérjük a panóz-folt intenzitását és ezt egy ismert aktivitású standarddal hasonlítjuk össze. A D. U.-érték. meghatározása. A D. U.-értéket a képződő redukáló cukrok glukóz alakjában számított mennyiségből kapjuk meg, ha ezt a keményítő hidrolizálása útján elméletileg nyerhető glukóz-mennyiséggel osztjuk és li00-zal szorzunk. A D. U.-érték meghatározása az alábbi módon történik: Egy szokásos módon, a keményítő híg sósavval vagy alfá-amilázzal való hidrolízise útján előállított kb. 30%-os keményítő-hidrolizátumhoz egy kb. 3—10 E aktivitású amilogiukozidáz-oldatot adunk, 1 g keményítőre számítva. Az elegy pH-értékét 4,0-ra állítjuk be,, majd a 3