155718. lajstromszámú szabadalom • Eljárás acetilglukozidok előállítására lanatozid-vegyületek mikrobiológiai átalakítása útján

5 nyészeteket állítunk elő, úgy ezek között olyan mutáns kultúrák is találhatók, amelyek az acetildigitoxinon nem idéznek elő változást, tehát acetildigitoxin-észteráz-negatívak. Ezzel szembe a változatlan hatásfokkal képesek az eredeti la- 5 natozid-szubsztrátumból a szekunder glukozid képzést elvégezni, tehát a béta-glukóz-csoportot lehasítják, anélkül, hogy ehhez dezacetilezés folyamatára szükségük lett volna, vagy az átalakítás során akár csak részben is hidrolizálnák az 10 acetilészter-kötéseket. Találmányunk tehát a Fusarium-fajok két eddig ismeretlen tulajdonságának felismerésén és ipari hasznosításán alapul, ti., hogy ezek egyrészt általában az acetil-csoportot tartalmazó 15 lanatozidok esetében is képesek a végálló glukóz molekulájának lebontásához, sőt ezt a más vegyületek esetében elértnél sokkal jobb hatásfokkal végzik; másrészt viszont találhatók — különösen a mutagen behatásoknak alávetett 20 kultúrákban — olyan Fusarium-törzsek, amelyek ugyanezen szubsztrátumon dezacetilezést nem végeznek és a béta-glukózcsoportot az acetilcsoport eltávolítása nélkül is változatlan hatásfokkal képesek lehasítani. Az ilyen képességet 25 mutató törzsek a célszerűen mutagen behatásnak alávetett Fusarium-kultúrák egykonidium-tenyészetei közül az acetiltartalmú glukozidokkal szembeni aktivitás kísérleti vizsgálata alapján szelektálhatók. 30 Az ilyen tulajdonság alapján szelektált Fusarium-törzsek micéliumsejtjei tapasztalataink szerint a maximális aktivitást kukoricalekvár-tartalmú táptalajon érik el. A 48 óra alatt kifejlődő dús micéliumot a lanatozidok átalakításához cél- 35 szerűen a táptalajtól elválasztjuk, és a leszűrt, de nem szárított és nem extrahált ép micélium vizes szuszpenzióját alkalmazzuk. Az ilyen szuszpenzióhoz az átalakítandó lanatozidelegyet alkoholos oldatban adjuk, oly koncentrációban, hogy 40 a közeg literenként 1—2 g átalakítandó lanatozidot tartalmazzon, a közegben jelenlevő alkohol mennyisége azonban ne haladja meg a 6%ot. Az ennél nagyobb alkohol-koncentráció hátrányos a mikroorganizmusok aktivitására. Az 45 átalakítás enyhe levegőztetés mellett, 24—26 C° körüli hőmérsékleten kb. 72—96 óra alatt folyik le; az átalakítás befejeztével a keletkező acetilglukozidok ismert módon extrahálhatók és nyerhetők ki a mikrobiológiai átalakítás vizes köze- 50 géből. A találmány tehát oly eljárás szekunder acetilglukozidok előállítására lanatozid-vegyületekből enzimes glukóz-lehasítás útján, amelyet az jellemez, hogy az átalakítandó lanatozidokat, pl. a 55 drogból izolált nyers lanatozid-elegyet a béta-glukóz-végcsoport lehasítására képes (lanatozid-béta-glukozidáz-pozitív), de az acetil-csoportot le nem hasító (lanatozid-észteráz-negatív) Fusarium-törzs micéliumával, legfeljebb 6% alkoholt 60 tartalmazó vizes közegben inkubáltatjuk, majd a keletkező acetilglukozidokat vízzel nem, vagy csak részben elegyedő szerves oldószerrel, vagy oldószereleggyel extraháljuk a vizes közegből. Az átalakítás céljaira előnyösen mutagen be- 65 6 hatásnak alávetett lanatozid-béta-glukozidázpozitív Fusarium-kultúrából, a lanatozid-észteráz-negatív jellegnek, tehát az acetil-lehasítóképesség hiányának kísérleti vizsgálata alapján szelektált Fusarium-törzset alkalmazunk és az átalakításhoz felhasználásra kerülő micéliumot előnyösen 0,2—3,0% kukoricalekvárt, valamint szénforrásként szénhidrátot, pl. glukózt, vagy laktózt tartalmazó, 4,5—6,5 körüli pH-értékű folyékony táptalajon termeljük, majd a leszűrt micéliumot 4,0—5,5 körüli pH-értékű vízben szuszpendáljuk és ehhez a szuszpenzióhoz adjuk az átalakítandó lanatozidok alkoholos oldatát, a fentebb már említett koncentráció-viszonyok betartása mellett. Az átalakítást enyhe levegőztetés mellett, 24—26 C° körüli hőmérsékleten az átalakulás gyakorlatilag teljes (95% körüli hatásfokú) végbemeneteléig folytatjuk, amihez a kiinduló anyagtól és a fermentációs körülményektől függően 48—96 óra szükséges. Az átalakulás előrehaladása a közegből kivett mintából szerves oldószerrel extrahált glukozidok vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatával ellenőrizhető. Az átalakítást nem szükséges steril körülmények között lefolytatni, célszerű azonban az idegen fertőzések kiküszöbölése érdekében a közeghez kis mennyiségű, 0,01—0,05% formaiint adni. Kiindulóanyagként akár a Digitalis lanata drogból izolált, A-, B- és C-lanatozidot együtt tartalmazó nyers lanatozidelegy, akár valamely izolált lanatozid alkalmazható. A találmány szerinti eljárás előnyös kiinduló anyaga lehet az „Izolanid" kereskedelmi elnevezés alatt forgalomba kerülő C-lanatozid-készítmény gyártásának melléktermékeként keletkező, főként A-lanatozidot és kisebb mennyiségben B- és C-lanatozidot tartalmazó glukozid-elegy, amelyből kívánt esetben az egyik, vagy másik alkotórészt ismert módszerekkel előzetesen el is távolíthatjuk, vagy ezek valamelyikét fel is dúsíthatjuk és így a találmány szerinti eljárással főként pl. acetildigitoxint (A-lanatozidból), vagy acetildigoxint (C-lanatozidból) nyerhetünk. A találmány szerinti eljárás a fentebb idézett, korábbi mikrobiológiai dezlanozid-átalakítással szemben jelentős előnyökkel bír, amennyiben: 1. Nem szükséges a szubsztrátum előzetes dezacetilezése, ami csak bizonyos veszteséggel végezhető el. 2. Vegyes lanatozidból kiindulva a szekunder glukozidok acetilezett formában kerülnek extrahálásra és mint ilyenek kémiai úton egymástól könnyebben elválaszthatók. 3. A-lanatozidot vagy A-lanatozidban dús szubsztrátumot alkalmazva acetil-digitoxint kapunk, amely az eddig ismert módszerrel csak digitoxin mellől, nehéz és költséges kémiai lépésekkel volt izolálható, vagy digitoxinból kémiai acetilezéssel volt nyerhető. Az acetildigitoxin a digitoxinnál kedvezőbb farmakológiai tulajdonságokkal rendelkezik, amennyiben azonos hatásintenzitás és azonos negatív kronotróp hatás mellett kevésbé kumulálódik, nagyobb a terápiás szélessége, kisebb az intoxikációs veszély 3