155718. lajstromszámú szabadalom • Eljárás acetilglukozidok előállítására lanatozid-vegyületek mikrobiológiai átalakítása útján

155718 elegyből a C-lanatozidot elkülönítjük, majd a visszamaradt A-lanatozidot valamely e célra alkalmas enzimkészítménnyel bontjuk le acetildigitoxinná. Enzimként erre a célra is felhasználhatók a Digitalis lanata, vagy a Digitalis purpu- 5 rea enzimjei; ebben a tekintetben külön előny, hogy a friss, vagy szárított Digitális-növénynek a szerves oldószeres kezelés utáni maradékából nyert enzim már nem idézi elő az itt nem kívánatos mellékreakciót, az acetilcsoport lehasítá- 10 sát; így tehát pl. a Digitalis lanata növényből származó digilanidáz enzim segítségével az A-lanatozidból egységes acetildigitoxin állítható elő. (vö. A. Stoll, C. Kreis, Helv. Chim. Acta, 17, 592, 1934). 15 A Digitális-növényből nyert enzimekkel végzett átalakítás azonban fenti előny ellenére sem tekinthető korszerű eljárásnak, mert még ha 1 g glukozidhoz százszoros mennyiségű száraz levél anyagát is adjuk, akkor is csak 60—70%- 20 os átalakítást lehet elérni (vö. A. Stoll, A. Hofman, W. Kreis, Z. Physiol. Chem. 224, 249 1935). Az enzimkészítmény költséges volta mellett igen súlyos hátrány ez a gyenge átalakulási hatásfok, mert a visszamaradt átalakulatlan kiindulóanyag 25 elkülönítése további műszaki nehézségeket okoz (vö. 144 631 sz. magyar szab. leírás). Alkalmasabbnak bizonyulnak az ilyenfajta enzimes lebontási reakciók ipari lefolytatására a mikrobiológiai úton nyert enzimrendszerek, 30 minthogy a mikroorganizmusok szaporodása több nagyságrenddel gyorsabb, mint a magasabbrendű növényi, vagy állati sejteké, ugyanakkor éppen rendkívül gyors anyagcseréjük miatt a mikroorganizmusok rendelkeznek a legak- 35 tívabb enzimrendszerekkel. További előnyük adaptációs és mutációs készségük, amelynek alapján lehetővé válik a mikroorganizmusok enzimrendszerének a kívánt célnak megfelelő módosítása is. 40 Az alacsohyrendű gombáknak a digitáliszglukozidok lebontása terén való hasznosítására már 1951-ben történt próbálkozás (A. Stoll, J. Renz, A. Brack, Helv. Chim. Acta, 42, 397, 1951), amelynek során Penicillium, Aspergillus 45 és Claviceps fajokkal sikerült a digitálisz-glukozidokról glukózt lehasítani. Az átalakításhoz 1 g glukozidra 20—30-szoros mennyiségű micélium (száraz súlyra számítva) volt szükséges és egyéb speciesek esetében 95%-os átalakítási hatásfok 50 is elérhető volt. Ez a lebontás a fent idézett közlemény szerint azonban csak dezacetilezett A-lanatoziddal volt lefolytatható, mert a szerző szerint „az acetilcsoport a molekulát az enzimes bontással szemben rezisztenssé tette". Valószí- 55 nűleg az elért eredményeknek a dezacetilezett lanatozidokra való korlátozottsága okozta azt, hogy a mikrobiológiai glukózlebontás nem fejlődött tovább a digitálisz-eredetű szekunder glukozidok előállításánál (E. Heftmann: Biehemistry 60 of Plant Steroids, Annual Rev. of Plant Physiol. 14, 225,1963), hiszen a digitoxin előállítása a fentebb említett extrakciós enzimes bontással megoldottnak látszott. ; A Digitális-növény valamennyi értékes gluko- 65 zidjának gyógyászatilag legjobban hasznosítható alakban való kinyerésére ipari méretekben megvalósítható, gazdaságos eljárás csak olyan mikrobiológiai módszerrel lenne keresztülvihető, amelynél nincsen szükség a drogban jelenlevő acetilglukozidok acetilcsoportjának előzetes lehasítására ahhoz, hogy a béta-glukózcsoport a mikrobiológiai úton nyert enzimrendszerrel lehasítható legyen, hanem éppen ellenkezőleg, az acetilcsoport még a béta-glukóz lehasítása után kapott szekunder glukozidokban is megmarad. Ismeretes, hogy a Fusarium lini — melyet egy korábbi közlemény szerint a kardogenán aglukonnak 12-es helyzetben való hidroxilezésére találtak alkalmasnak (vö. A. Gubler, Ch. Táram Helv. Chim. Acta 41, 297, 1958) fel tudja használni szubsztrátként az acetil-glukozidokat is, így a fenti szerzők szerint hepta-O-acetil-echujinból szomalint, hepta-O-acetil-K-sztrofantozidból és tetra-O-acetil-K-sztrofantin-béta-d-glukozidból Cimarint, végül tetra-O-acetil-sztrofantidin-béta-d-glukozidból sztrof antidint hoz létre 37—57%-os átalakítással (vö. Ch. Tamm, A. Gubler Helv. Chim. Acta 42, 239, 1959). Fenti szubsztrátokkal szemben tehát ez a törzs béta-glukozidáz és acetilészter-hidroláz pozitívnak bizonyul. Minthogy célul lanatozid-vegyületek mikrobiológiai átalakítását tűztük magunk elé, melyek szintén acetil-tartalmú szívglukozidok, a Fusarium genus különböző specieseit tettük vizsgálat tárgyává és azt találtuk, hogy valamennyi vizsgált faj: Fusarium moniliforme, Fusarium scirpi, Fusarium caucasicum, Fusarium graminearum, Fusarium redoleus, Fusarium equiseti la~ natozid-beta-glukozidáz és lanatozid-észteráz pozitív volt. Egyes esetekben 70—90%-os hatásfokkal keletkezett a megfelelő szekunder glukozid. Az egyéb alacsonyrendű gombákkal nyert fenti tapasztalatok alapján feltételezhető volt, hogy a Fusarium-fajok említett kétféle aktivitásában elsődleges az észterkötés bontása, amellyel a sejt az acetil-csoport eltávolításával önmaga számára mintegy detoxikálja a lanatozidot, majd az így dezacetilezett terméken végzi el másodlagos reakcióként a dezacetilglukozidokból kiindulólag más mikroorganizmusok esetében is ismert glukózlehasítást. A következőkben ezért azt vizsgáltuk, nem lehetséges-e a Fusariumoknak olyan változatait, vagy mutánsait találni, amelyeknél az említett kétféle aktivitás közül csak a béta-glukóz-lehasító aktivitás áll fenn, amelyekkel tehát vizsgálható lenne, hogy a natív lanatazidokból az acetilcsoport lehasítása nélkül is képesek-e a béta-glukóz-csoportot lehasítani és így közvetlenül az acetil-csoportot megtartó szekunder glukozidokat előállítani. Meglepő módon azt találtuk, hogy ha nagy béta-glukozidáz-aktivitással rendelkező Fusarium-specieseket mutagen hatásoknak, pl. ibolyántúli, vagy röntgen besugárzásnak, mutagen kemikáliák, mint etilmetánszulfonát hatásának teszünk ki és az így kezelt tenyészetek egyes konidiumait elkülönítve, azokból külön-külön te-2