155421. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Propionibacterium-tenyészetek B12-vitamin-termelésének fokozására
155421 tényezője a maximális Bi2-vitamin kihozatal elérésének. A tapasztalat azt bizonyítja, hogy a savtermelés és a B12 -vitamin termelése nem halad feltétlenül párhuzamosan. Az intenzív B12 -vitamin termelése egy adott pH tartományhoz van kötve, amelynek optimuma pH 6,5 és 7,5 közé esik. Nyilvánvaló tehát, hogy minden olyan művelet, amely ezt a kedvezőnek tekinthető pH-tartományt folyamatosan biztosítja, a B12 -vitamin termelés emelésére vezet. A jelen találmány lényege abban foglalható össze, hogy egyetlen, ill. kevés művelet révén biztosítja a jelzett optimális pH tartomány folyamatos fenntartását. A szakirodalom közölt eljárások szerint 4—6 óránként állítják be lúgos oldatokkal a pH, amivel azt érik el, hogy a pH 1—2 órán át optimális tartományon belül marad, majd fokozatosan csökken az értéke, ami a B12-vitamm termelése szempontjából előnytelen. A pH rövidebb időközökben való utánállítása elvileg megvalósítható, gyakorlatilag azonban eddig nem nyert megoldást költségessége és munkaigényessége folytán. Kísérleteink során azt találtuk, hogy az optimális pH-érték folyamatosan biztosítható akkor, ha a Propionibacterium-fermentáció irodalmában leírt szokásos alkáliákkal való pH állítás helyett pontosan meghatározott feltételek mellett NaHiCQ3 -t adunk a táptalajhoz, ill. a baktériumtenyészethez. A jelen találmány e feltételeket adja meg. Ismeretes, hogy a NaHC03 is lúgos vegyhatású anyag. 1—3%-os vizes oldatainak pH-ja 9 felett van, sőt ha levegőt fújunk rajta keresztül vagy sterilizáljuk az oldatot, pH-ja C02 -veszteség folytán 10 fölé emelkedik. Ha tehát NaHC03 rt főzünk bele, vagy adunk hozzá feleslegben a táptalajhoz, annak pH-ja éppen úgy a propíonibaktériumok számára elviselhetetlenül magas értékre emelkedik, mint ha az előbb említett alkáliákat adjuk hozzá a táptalajhoz. A NaHíCQ3 viselkedése azonban lényegesen eltér a szokásosan használt és leírt alkatiakétól — és ez találmányunk alapja, — ugyanis ha a NaHCOg-t olyan savanyú tenyászsdhez adjuk hozzá, ill. a NaHC03 tartalmú táptalajt olyan mennyiségű savanyú vegyhatású tenyészettel oltjuk be, hogy a NaHCCK- és a szerves savak reakciója folytán felszabaduló szénsav a folyadékot telítse (a fermentáció hőfokán egy térfogat tenyészet 1 atm. nyomáson kereken 1 tértfogat normál C02-t tart oldatban) olyan rendszer keletkezik, amelyben a fölös mennyiségű NaHiCOs és a szénsav egyensúlya folytán éppen a propionijbaktóriumok Bi2-vitamin-bicszintézise számára optimális pH-'viszonyak állnak elő. Ha a fermentáció várható teljes savtermelésének a közömbösítéséhez szükséges mennyiségű NaHCOgr t adjuk hozzá .a tenyészethez, elérjük, hogy a fermentáció egész tartama alatt optimális lesz annak pH-ja. Ezzel a következő előnyöket érjük el: • 10 15 20 40 50 55 60 65 a) biztosítjuk a mikroorganizmusok legkedvezőbb fejlődését és a maximális BJ2 -vitamin hozamot; b) feleslegessé válik a tenyészet pH-jának ellenőrzése és állítgatása; c) megtakarítjuk a pH-állításíhoz szükséges munkaerőt; d) elkerüljük a periodikus pH állítással járó hibaforrásokat: esetleg túlMgosítást, elégtelen lúgosítást, fertőzést stb.; e) elkerüljük a szakaszos pH állításnál elkerülhetetlen pH-hullámzást, amely a baktériumok számára kedvezőtlen; f) csökkentjük a termelt propionsav toxikus hatását a baktériumokra, mert ez a hatás szabad sav jelenléte esetén erősebb mint semleges propionát esetén (Kiesel A.-Ann. Inst. Pasteur 27 391). A NaHC03 hozzáadása után a tenyészet minden külső beavatkozás nélkül fenntartja a kedvező pH-ját. A log-fázisban lévő tenyészet ugyanis intenzíven termel szerves savakat és szénsavat. Egy molekula szerves sav úgy reagál a NaHCO—al, hogy egy molekula C02 szabadul fel. Eszerint igen sok szénsav termelődik, ami biztosítja, hogy a tenyészet állandóan telítve marad szénsavval, a felesleg viszont elszáll és ez a körülmény biztosítja a túlsavanyodás elkerülését. Ez így megy mindaddig, amíg a szénhidrátiforrás (általában glukóz) el nem fogy. Miután azonban számított mennyiségű Na-HCOs-t adunk a táptalajhoz, a glukóz ás a NaHC03 nagyjából egyszerre fogy el. Ha számítás nem is egész pontos, a fermentáció legvégén kialakult Na-acetát (propionát)-ecetsav (propionsav) puffer biztosítja, hogy a kedvező pH-értéktől lényeges eltérés már nem következhet be. A savtermelés révén az állandó optimális pH-t maga az erjedés, egy biokémiai folyamat tartja fenn és ez a mechanizmus a C02 fokozatos eliminációja alapján bizonyos fokig hasonlít (bár sokkal tökéletlenebb) ahhoz a folyamathoz, amely az emberi szervezetben az állandó pH fenntartását biztosítja. A szükséges NaHC03r mennyiséget a következő alapon számítjuk ki: ismeretes, hogy Propionibacteriumok lényegileg a rendelkezésükre álló cukrokból termelnék savat, mégpedig úgy, hogy 1 molekula hexózból egy molekula C02 és nagyjából 1 molekula ecetsav ill. propionsav keletkezik. C6 H 12 0 6 • C 2 H 4 0 2 + C 3 H 6 0 2 + C0 2 + H 2 , ahol is a H2 nem, szabadul fel gáz alakiban, hanem egyéb anyagcserefolyamatokban kerül felhasználására. Miután a C02 nem szorul semlegesítésre, 1 mól glukózra 2 mól NaHC03 -t kell számítani. Ezt a mennyiséget egy vagy több részletben lehet hozzáadni a tenyészethez. A NaHO03 akkor nem Mgosítja túl a tenyészetet, ha a savval való reakció folytán annyi C02 keletkezik, amennyi az oldat telítéséhez elegendő, ill. a biztonság kedvéért ennél kissé több. Könnyen kiszámítható, hogy 1 liter oldat 2
