155421. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Propionibacterium-tenyészetek B12-vitamin-termelésének fokozására
155421 5 6 telítéséhez 1 liter normál CO2, vagyis 2 g szükséges. Miután az ecetsav és propionsav ekvirnolekuláris keverékének átlagos molekulasúlya 67, a C02 -é pedig 4:4, továbbá egy mól szerves sav semlegesítésékor 1 mól C02 szabadul fel, 2 g C02 keletkezéséhez kereken 3 g szerves sav semlegesítése szükséges. A NaHC03 beadása tehát akkor időszerű, amikor a tenyészet 0,3% savat tartalmaz, ül. -amikor kb. 0,45%nyi glukóz elerjedt, ill. a tapasztalat szerint, amikor a tenyészet pH-ja 5 alá süllyedt. Miután a NaHGOa elég rosszul oldódik, nagyobb (mennyiségét oldatban hozzáadva a tenyészethez, az utóbbi fellhígul. Ezért, ha szigorúan steril körülmények közt akarunk dolgozni, célszerű úgy eljárni, hogy a számított mennyiségű NaiHCOs-t tömény oldatban sterilizáljuk és a tenyészet táptalajának elkészítésekor anynyival kevesebb vizet teszünk hozzá, mint amennyit ez a NaHCO-s oldat tartalmaz. így a tenyészetet a N.aH'003-oldattal végeredményben a kívánt töménységűre hígítjuk. Eljárhatunk úgy is, hogy a NaHCOs-oldatot nem vízben, hanem táptalajban oldva sterilizáljuk és így adjuk hozzá a tenyészetlhez: pl. 1 térfogatrész tenyészelhez 1 térfogatrész táptalajban oldott NaíH'CO.j-t adunk hozzá, ekkor azonban a NaHCO.i mennyiségét természetesen az összes glukózra kell vonatkoztatni. Ilyenkor a tenyészetnek annyi szabad szerves savat kell tartalmaznia, hogy az az össztérfogatra vonatkoztatva elérje a 0,í3'%-ot. Ha nem sterilen, hanem félifolyamatos és félsteril körülmények között dolgozunk, a NaHC03 -t szilárd állapotban porítva beöntihetjük a készülék >munkanyílásába keverés közben és e keverést addig folytatjuk, míg a só feloldódik ill. a pezsgés megszűnik. -Eljárásunk további részét a példákban ismertetjük. Példák: 1. A 151 0)1(9 sz. magyar szabadalom szerinti táptalajt készítettünk 2P/0 glukóz tartalommal. Ezt 400 midként 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba fejtettük, a lombikokat három csoporba osztottuk és az alábbi kezelésnek vetettük őket alá: a) A táptalajokhoz 2%-nyi NaiH)C03 -t adtunk és 120 C°-on 20 percig sterilizáltuk. A táptalaj pH-ja 10 fölé emelkedett. 10 ml Propionibacterium shermanii tenyészettel beoltva fejlődést nem észleltünk, fo) A táptalajokihoz sterilizálás után adtunk hozzá 2%r-nyi NaH'C03 -t. A pH 8,7^8,8-ra emelkedett. 10 ml Propionibacterium isihérmanii tenyészettel beoltva fejlődést nem észleltünk. e) A táptalajokat sterilizáltuk (pH 7,2 sterilizálás után) és beoltottuk: 10 ml Propionibacterium shermanii oltóanyaggal. A 3. napon a pH 4,:8—4,9-re csökkent. Ekkor hat lombikhoz 2%-nyi NaH€03 -t adtunk, niire élénk pezsgés közben a pH 7 körüli értékre emelkedett. A lombikokhoz az 5. napon 2 Mg/ml 5,16-dimetil-benzimidazolt adtunk, és a hetedik napon, Bi2 -vitamin meghatározást végeztünk. A fermentáció végére a pH 6,4-ig csökkent. Az átlagos Bií-vitamintartaloim 12,0 /ig/ml volt. Azonos táptalajon azonos körülményeik közt, de szakaszos, NH4 OH-fval végzett pH állítással levezetett kísérleteknél az átlagos Bi2 -vitamin érték 7,8 /ig/ml-t tett ki. 2. A 151 OH© sz. magyar szabadalomban megadott táptalajt 400 ml-ként 12 db. 900 ml-es Erlenmeyer-lömbibba fejtettük és sterilizáltuk. A steril táptalajokhoz 2,%-nyi steril glukózt adtunk hozzá, 50%-os oldat formájában és beoltottuk őket lombikonként 5 ml Propionibacterium Siherimanii-tenyéiszettel. A lombikokat 26 C°-on tenyésztettük. Négy nap elteltével minden lombik további 2%-nyi glukózt, 2 mg/l Co-t kapott mint adalékot, és a lombikok felélhez 7,5 g NaBC03-t adtunk hozzá, míg a többi lombikban ettől az időponttél kezdve periodikusan állítottuk 7,2"—7,.3-ra a pH-t NH/jOH-oldattal. Az első hat lombik a 8. napon újabb 7,5 g NaHC03 -adalékot kapott, a 7. napon valamennyi lombiklhoz 2 mg/l-nyi 5,6--dimetilbenzimidazolt adtunk és a 9. napon meghatároztuk a B^-vitamin-tartalmat. Azt találtuk, hogy a NaH'G03 -al kezelt lombikok B12 -vitamin-tartalma átlagban 23,6 ^g/rnl volt, míg azoké a lombikoké, ahol a pH-t periodikusan állítottuk, 11,2 /ig/ml. 3. 0,4 liter 72 órás Propionibacterium shermanii-tenyészetet, amelynek pH-ja 5,0 volt, beoltottunk 0,8 Éter (az 1. példában megadott összetételű, 2% glukózt tartalmazó!) táptalajba, amelyhez sterilizálás előtt hozzáadtunk 22,5 g NaHC03-ot (pH a sterilizálás után 10 felett), összekeverés után a pH 7,4 volt és a fermentáció végéig fokozatosan 6,4-re csökkent. A Bi2 -vitamin termelés 10,9 [tgftncü volt. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás Propionibacterium-tenyészetek Bi2 -vitamin-terimelésének fokozására azzal jellemezve, hogy a táptalajhoz sterilizálás előtt vagy után, minden jelenlevő szénhidrát-molekulára számítva 2 molekula NaH0O3 -ot adunk és olyan mennyiségű és minőségű oltóanyaggal oltjuk be, amely az össztérfogatra számítva legalább 0,;3%, az erjedés folyamán keletkezett szerves savat tartalmaz, ill. a beoltott baktériumtenyészethez, amely legalább 0,,3i% erjedés folyamán keletikezett szerves savat tartalmaz, adunk minden mól erjedőképes monDszaharidára számítva 2 mól NaHO03-ot. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a számított 10 15 20 25 80 35 40 45 50 55 60 3
