155123. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szteroidok mikrobiológiai előállítására
155123 adjuk a közeghez, minthogy az inhibitor megfelelő koncentrációban való hozzáadása esetén a baktériumok nem pusztulnak el. Ez könnyen kimutatható, ha a szteroid és az inhibitor hozzáadása után a kultúrát egy megfelelő tápközegre visszük át a további életképességről való meggyőződés céljából. A szteroid konverziója állandó szellőzés közben, 20 C° és 45 C° között változó hőmérsékleten mehet végbe, bár adott esetben ennél alacsonyabb vagy magasabb hőmérséklet is alkalmazható. Előnyös, ha a konverziót 30 C° hőmérsékleten folytatjuk le, bár nem szükséges.' hogy a kultúra szaporítási időszakában és a lebontási időszakban ugyanaz a hőmérséklet álljon fenn. Eljárhatunk oly módon is, hogy a baktériumokat 24 óra hosszat hagyjuk fejlődni 26 C° hőmérsékleten, majd hozzáadjuk a szteroidot és az inhibitort és a hőmérsékletet 30 C°-ra emeljük. A szteroid hozzáadása után a konverzió^ 1—7 nap alatt megy végbe, bár általában a kívánt végtermék hozama a hozzáadás utáni első három napot követő időben már nem növekszik tovább. Az A-gyűrűben további helyettesítőket nem tartalmazó szteroidok esetében az eljárás fontos faterméke az l,4-androsztadién-3,17-dion, kismennyiségű 4-androsztén-3,17-dion mellett; a hozam nagysága egyebek között a szellőzés mértékétől is függ. A leírt körülmények betartása esetén az l,4-androsztadién-.3,ll7-dion túlsúlyban keletkezik a 4-androsztén-3,17-dion mellett, ami gyakorlati szempontból kívánatos is. A képződött szteroidot valamely vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, pl. metilizobutilketonnal, etilacetáttal, metilénkloriddal vagy kloroformmal extrahálhatjuk a fermentációs közegből. A szerves oldószeres kivonatot ezután szárazra pároljuk és a maradékot szerves oldószerrel extraháljuk az át nem alakult kiindulóanyag, pl. koleszterin vagy sztígmaszterin eltávolítása céljából. A visszamaradó szilárd anyagot azután további tisztításnak és szétválasztási műveletnek vethetjük alá, pl. kromatográfiás módszerrel vagy átkristályosítás útján. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik: 1. példa: Mycobacterium phlei KNGSF 70 törzsből inokulum-kultúrát készítünk oly módon, hogy a törzset agár táptalajra oltjuk és 3 napig 30 C° hőmérsékleten inkubáltatjuk oly tápközegben, amely 10 g élesztőkivonat (Difco) 1 liter vízvezetéki vízzel készített, 6,8 pH-értékű, előzetesen 110 C°-on 30 percig sterilizált oldatából áll. A tápközeget 2 literes lombikba töltjük, lombikonkint 500—500 ml-t. A kultúrákat 48 óra hosszat rázatjuk 30 C° hőmérsékleten forgó rendszerű rázóberendezésben, percenkint 250 fordulattal, 2,5 cm lökethosszal; ez idő alatt a baktériumok kellően elszaporodnak ahhoz, hogy tovább lehessen oltani őket. 5 A főfermentációs közeget oly módon állítjuk elő, hogy 5—15 g kukoricalekvárt (szárazanyagra számítva) vízvezetéki vízzel 1 literre hígítunk, majd a folyadék pH-értékét híg nátriumhidroxid oldattal 7,0-ra állítjuk. Ezt a közeget há-10 rom lombikban készítjük el, mindegyik 2 literes lombik 1—1 liter mennyiséget tartalmaz. A lombikokat 30 percig sterilizáljuk 120 C° hőmérsékleten. Ezután az egyes lombikokat beoltjuk a fent leírt inokulum-kultúra 50—50 ,ml-15 jével (az inokulum mennyisége tehát 5%). A lombikokat a fent leírt rendszerű rázóikészülékben 48 óra hosszat rázatjuk 30 C° hőmérsékleten. Mindegyik lombik tartalmához 1 g koleszte-20 rint adunk vizes szuszpenzió alakjában; ezt a szuszpenziót oly módon készítjük el, hogy a koleszterint 0,1% „Tween—80" diszpergálószerrel elegyített víz jelenlétében mozsárban porítjuk. Ezenkívül 750 mg NiS04 -7H 2 O steril vizes ol-25 datát adjuk mindegyik lombikhoz; a hozzáadott mennyiség 157 mg nikkel-ionnak felel meg. A lombikokat ezután a fent megadott egyező körülmények között tovább rázatjuk. Már 12 órával a koleszterin hozzáadása után 1,4-androszta-30 dién-:3,17-dion jelenléte mutatható ki vékonyrétegű kromatográfiával. Erre a célra Stahl előírása szerint „Silica gel G" szilikagélt alkalmazunk és 10 : 1 térfogatarányú kloroform-etilacetát eleggyel eluálunk. 35 Három napi rázás után a 3 lombik tartalmát egyesítjük és az elegyet 1/5 térfogat metilizobutilketonnal háromszor extraháljuk. A kivonatot csökkentett nyomás alatt szárazra párol-40 juk és a maradékot 20 ml forrásban levő metanollal extraháljuk, Ezáltal eltávolítjuk az át nem alakult koleszterint. A maradékból 1,6 g koleszterin nyerhető ki. A metanolos oldat tartalmazza a kívánt terméket. Ezt az oldatot 45 bepároljuk szárazra, majd 8 ml benzollal felvesszük a maradékot és az így kapott oldatot egy 30 g alumíniumoxidot (Woelms előírása szerinti semleges, III aktivitású A120 3 ) tartalmazó oszlopon kromatograif áljuk. Az oszlopot 50 benzol és aceton 10 : 1 arányú elegyével eluáljuk és vékonyrétegű kromatográfiával megállapítjuk, hogy mely frakciók tartalmaznak l,4-androsztadién^3,17-diont. Ezeket a frakciókat egyesítjük és bepároljuk. 55 A maradékot aceton és heptán 1 : 3 arányú elegyéből átkristályosítjuk. Ily módon 160 g kristályos terméket kapunk, amelyből újbóli átkristályosítással végülis 138 mg tiszta termékhez jutunk. Ez az elhasznált koleszterin 60 mennyiségére számítva, 13,4%-os termelési hányadnak felel meg. A termék olvadáspontja 137,5—139 C°; az analitikai tisztaságú androsztadién-dion 137—• 65 138 C°-on olvad. A két kristályos termék elegye S
