155081. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az enduracidin antibiotikum előállítására

11 d-galaktóz +++ nátriumcitirát ++ d-glükóz ++ . keményítő +++ d-mannóz +++ kontroll + glicerin -\—|—\d-ifruktóz H—|—h ramnóz H—I—h melibióz + Jelmagyarázat: + gyenge fejlődés. + íejlődik, -j—j- mérsékelten fejlődik, -|—|—h bőségesen fejlődik. A találmány szerinti eljárás értelmében oly módon járunk el, hogy a Streptomyees-fajhoz tartozó, enduraeidin-termelő törzset egy oly tápközegen inkubáltatjuk, amely asszimilálható szénforrást, asszimilálható nitrogénforrást és egyéb szükséges tápanyagokat tartalmaz. Szénforrásként pl. keményítő, glükóz, laktóz, maltóz, galaktóz, szacharóz, dextrin, glicerin vagy köles-kocsonya alkalmazható. Nitrogénforrásként pl. pepton, szójaliszt, kukoricalekvár, húskivonat, ammóniumsó, szerves vagy szervetlen nitrogénvegyületek használhatók. Ezenkívül kismennyiségű szervetlen sót, mint kalcium-, cink-, mangán-, vas- stb. kloridot, továbbá foszfátokat is kell a táptalajhoz adnunk. Szükség esetén adhatunk még a táptalajhoz szokásos táp-tfaktorokat, habzásgátlószereket, mint állati olajokat, viaszokat, növényi olajokat vagy ásványi olajokat is. Az enduracidin-terrnelő törzset előnyösen folyékony táptalajon, alámerülő, rázott kultúrában tenyésztjük. Szükség esetén azonban alkalmazhatunk nyugvó kultúrát is. A tenyésztési feltételeket, mint a hőmérsékletet, a tenyésztés időtartamát és a közeg pH-értékét oly módon szabjuk meg, hogy az adott körülmények között maximális enduracidin-termelést érjünk, el. Alámerülő kultúra alkalmazása esetén a maximális enduracidin-termelés általában 25 C° és 45 C° közötti hőmérsékleten, semleges körüli pH-értéken, kb. 3—.10 napi tenyésztéssel érhető el. Az így termelt enduracidin főként a micéliumokban gyülemlik fel, egy része azonban a folyékony tápközegben jelenik meg. Az így felgyülemlett enduracidint az anyag természetének megfelelő, önmagukban ismert eljárási műveletekkel nyerhetjük ki és tisztíthatjuk a kívánt tisztasági fokra; a kinyerés során hasznosíthatjuk pl. az enduracidin és a szennyezések között fennálló oldhatósági különbségeket, továbbá a két folyádékfázis közötti megoszlási hányados, az adszorbeálódó képesség és az ion-koherencia terén fennálló különbségeket is. Minthogy az enduracidin nemcsak a micéliumokban gyülemlik fel, hanem a fermentációs termék folyadékfázisában is, a kinyerés során célszerűen oly módon járhatunk el, hogy először a micéliumot elkülönítjük a folyadékíázistól, majd a micéliumot is és a folyadékfázist is a megfelelő kinyerési és tisztítási műveleteknek vetjük alá. 12 Az enduracidin elkülönítését és tisztítását gyakorlatilag célszerűen oldószeres extrakcióval végezhetjük; a legjobb eredményeket akkor kap_ juk, ha az enduracidint n-butanollal extrahál-5 juk bázisos közegben, majd vizes savoldattal extraháljuk a szerves fázisból. Az enduracidin elkülönítése és kinyerése során felhasználhatjuk az anyag oly tulajdonságait, .melyek értelmében az enduracidin pl. alká-10 likus körülmények, között (kb. 8,0-nál nem kisebb pH-értéken) adszorbeálódik a'ktívszénen, majd erről szerves oldószerrel, pl. savas vizes acetoamal és vizes metanollal extrahálható, kation- vagy anioncserélő gyantákon, mint Arriber-15 lite IR—120 és Amberlite IR—-45 gyantán viszont nem adszorbeálható. Az enduracidin kinyerése extrakció útján célszerűen az alább leírt példa szerinti módon vifelezhető ki. 20 A tápközegből elkülönített micéliumokat vízzel mossuk, majd kétszer, előbb semleges, majd savas körülmények között extraháljuk szerves oldószerrel, pl. 50—70%-os vizes aceton 3—4-szeres mennyiségével, 50—70'%-os metanollal 25 vagy hasonlókkal, szobahőfokon, kb. 3 óra hoszszat. Az így kapott kivonat nagymennyiségű enduracidint tartalmaz és erős antibiotikus aktivitást mutat gram-positiv baktériumokkal szemben. A 30 kivonat pH-értékét azután 5 és 6 közöttire állítjuk be, majd vákuumban betöményítjük az aceton ledesztiilálása útján, azután kénsavval 3 pH-értékre savanyítjuk, 1/3 térfogat etilacetátot adunk hozzá és az elegyet rázzuk, hogy az old-35 ható anyagok az etilacetát-irétegbe menjenek át. A némi csapadékot tartalmazó vizes fázist elkülönítjük az etilacetát-rétegtől, nátriumhidroxiddal, nátriumkarbonáttal vagy nátriumhidrogénkarbonáttal 8 pH-é:rtékre állítjuk, azután 40 1/3 térfogat, n-butanollal extraháljuk. A n-butanolos extrahálást még egyszer megismételjük, az egyesített n-butanolos fázist ennek össztérfogatára számított V2 térifogat vízzel mossuk, majd vizes savoldattal (pl. 2 pH-érté-45 ken, n/200 sósav oldattal vagy n/í2O0 kénsav oldattal) extraháljuk és így a hatóanyagot a vizes savas oldatba visszük át. A vizes oldatot azután ismét a fent említett 50 módon n-butanollal extraháljuk. Az így kapott n-butanolos réteg tartalmazza a micéliumokban termelt enduracidint, nagy termelési hányaddal. Megismételjük a vizes sósav oldattal való extrahálást és a n-butanolos. fázisba történő viszszaoldást és így jóval nagyobb koncentrációban kapjuk a hatóanyagot. Ezt a n-butanolos fázist betöményítjük, vízzel mossuk, majd vákuumban még tovább töményítjük be alacsony hőmérsékleten és így a inbutanol főtömegét ledesztilláljuk; csupán csekély mennyiségű n-butanolt hagyunk a rendszerben. Ezt az így kapott betöményített n-butanolos terméket azután tízszeres térfogát éterrel elegyítjük, amikoris a hatóanyag sárgásbarna csa-65 padék alakjában leválik; ezt szűréssel elkülö-6