154936. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ACTH-hatású peptidek előállítására
154936 11 12 vétlenül a kromatográfiásan egységes terméket amorf por alakjában nyerjük. Ennek súlya 1,49 g, nem éles olvadáspontja kb. 175—190 C°. A termék vékonyréteg-kromatogramos elemzése szilikagélen az alábbi Bf-értéköket mutatja: Rf (43A) 0,41 Rf (kloroform-metanol = 9 : 1) 0,24 7. (BOC)-Szer-Tir-Szer-Met-Glu(OtBu)-Hisz-Fe-Arg-Tri-Gli-Liz)(BOiC)-Pro-Val-Gli-Liz(BOC)-Lizi(BOC)nLiz(BOC)-tLiz(BOC). -Pro-val-Liz(BOC)-Val-Tir-Pro-OtBu 252 mg BQC-Szer-TirHSzer-Met-Glu(OtBu)-Hisz-Fe-Arg-Tri-Gli^OH-t és 300 mg fentiekben leírt tetradekapeptidésztert 2>7 ml vízmentes piridinben szuszpendálunk. A szuszpenziót 0,1 ml víz és 0,2ili3 ml 1 n sósav hozzáadásával 50 C°-on keverés közben 30 percig reagáltatunk és így oldatba visszük. Ekkor első adagként 96 mg dieiklohexil-karbodiimidet adunk hozzá, majd 3 óra eltelte után hasonló súlyú második adagot. Az elegyet még 3 óra hosszat 50 C°-on keverésben tartjuk, majd 0 C°-ra lehűtjük, a kivált kristályos diciklohexilkarbamidot kiszűrjük és ezt 4 adag 0,5 ml .95%-os piridinnel utánaöblítjük. A szűrletiből 30 ml benzol hozzáadásával a terméket csapadék formájában leválasztjuk, 0 C°-on szűrjük, benzollal és petnoléterrel mossuk, végül szárítjuk. Az így kapott 550 mg anyagot egyszer metanolJbenzol-petroléter elegyből, majd metanol-víz elegyből átoldjuk és kicsapjuk. Ily módon előtisztítjuk. Végleges tisztítás céljából 10:3:5:4 arányban összetett metanol-puff eranyag-kloroform-széntetraklorid oldószerrendszer alkalmazásával Craig-féle elosztásnak vetjük alá. i(Pufferanyag = 2)8,5 ml jégecet-f-19,25 g ammóniumacetát 960 ml vízben.) Az elosztást 240 lépésben mindenkor 10 ml-es fázistérfogattal végezzük. A 61—90 elosztási lépések tartalmát Ul max = 76, K = 0,46) szárazra pároljuk és az ammóniumacetátot nagyvákuumban elszublimáljuk. Ily módon amorf por alakjában 256 mg tiszta, védett csoportokat tartalmazó tetrakozapeptid-acetátot nyerünk, amelynek olvadáspontja kb. 195—-205 C° (bomlik). A termék vékonyréteg-kromatogramos elemzése szilikagélen az alábbi Rf-értékeket mutatja: Rf (43A) 0,61 Rf '(100) 0,59 Rf (kloroform-metanol = 75*": 25) 0,39 10 15 20 25 35 40 45 50 55 8. H • Szer-Tir-Szer-Met-Glu-Hisz-Fe-Arg-Tri-Gli-Liz-Pro-Val-Gli-Liz-Liz-Liz-'Liz-Pro-Val-Liz-Val-Tir-Pro-OHi(Liz".i8-li Si.24-kortikotropin) 60 200 mg Védett csoportokat •'tartalmazó tetrakozapeptid származékot 4 ml 90%-os trifluorecetsavban feloldunk és 1 óra hosszat 22 C°-on állni hagyjuk. Az elegyet ezt követően kb. 1 ml 65 térfogatra bepároljuk, 10 ml vizet adunk hozzá, majd ismét kb. 2 ml térfogatra bepároljuk, végül liofilizáljuk. A liofilizált terméket (trifluoracetát származék) acetáttá átalakítjuk. Ehhez 7,5 mm átmérőjű és 18 cm magas acetátformában levő gyengén bázisos, ioncserélő oszlopon (pl. Merck Nr. II) átszűrjük. Az eluált anyagot kb. 2 ml térfogatra bepároljuk, liofilizáljuk. végül nagyvákuumban 40 C°-on utánszárítjuk. Ily módon 173 mg kromatográfiásan és elektroforetikus elemzéssel egységes Liz17' 18 -/? 1 ' 24 -kortikotropin-acetátot nyerünk fehér amorf por alakjában. A terméket alumíniumoxidon 101 rendszer alkalmazásával vékonyréteg-kromatogramos elemzésnek vetjük alá. A termék Rf-értéke 0,41. (/?1-24 -kortikotropin hasonló körülmények között 0,151 Rf-értékkel rendelkezik.) A termék elektroforézis során (16 Volt/cm) 6,1 pH-értéken (piridin-acetátos puffer) 2 óra alatt 8,4 cm távolságot vándorol a katód felé. A vegyület in vivo {hipofízisüktől megfosztott patkányokon Berthe—Desaulles et al. szerint NATURE 202, 1964, 908. oldal) háromszor hatékonyabb, mint a /?1_24-kortikotropin. A következő komponensekből szárazanyag-ampullát állítunk elő: Liz17 ' 18 -/? 1_24 -kortikotropin-hexaacetát 0,5 ml ZnS04 + 7 H 2 0 1,23 mg Na3 P0 4 + 12H 2 0 1,38 mg Mannit 40,0 mg Felhasználás előtt a szárazanyag ampulla tartalmat külön folyadék ampullában levő 1 ml desztillált vízzel elkeverjük. Ily módon szuszpenziót nyerünk, amelynek pH-értéke 7,6. 3. példa: Az alábbi komponensekből szárazanyag ampullát készítünk: Liz17 ' 18 -/? 1_24 -kortikotropin-hexaacetát 0,5 mg ZnS04 + 7 H 2 0 1,23 mg Mannit 40,0 mg A következő komponensekből álló folyadékampullát állítunk elő: Na3 P0 4 + 12H 2 0 Versene-Fe-3 Desztillált víz 1,38 mg 0,1 mg ad 1,0 ml Felhasználás előtt a szárazanyag- és folyadékampulla tartalmát elkeverjük. Az így kapott szuszpenzió pH-értéke 7,6. 4. példa: A következő komponensekből anyag-ampullát készítünk: álló száraz-6
