154699. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mumpsz-elleni vakcina előállítására

154699 3 4 A .találmány tárgyát oly eljárás képezi, amellyel a muimpsz-<vírust embrióméit tyúktojásokból készített szerv-Jkultumáihoz adaptáljuk és ezen szaporítjuk. A találmány szerinti eljárással legyengített élő mumpsz-vírus-vakcinát állítunk elő, csirke-embrió szövetkultúrán való sorozatos átvitel útján. A találmány szerinti eljárás a következő lépétsekfoől áll: a) virulens vírust különítünk el valamilyen sejt-kultúirán vagy embrioniált tyúktojás-szövetkultúrán és ezt a vírust csirke-embrió szövetkultúráihoz adaptáljuk; b) legyengített élő vírust képezünk csirkeemlbrió-szövetikultúrán való sorozatos átvitelek útján; c) az így nyert legyengített élő vírusból vakcinát készítünk. Az alábbiakban az eljárás e lépéseit különkülön fogjuk részletesen megmagyarázni. a).A virulens vírus elkülönítése és adaptálása. A onumpsz^vírus elkülönítését és adaptálását csirkeemibriónszövetkultúrán végezhetjük valamilyen klinikai kiindulóanyagból (pl. imümpszos betegek torok-kenetéből) vagy emibrionált tyúktojáson előzetesen szaporított vírusbál. A fertőzött kultúrák inkubációja 30—34 C° (optimálisan 32 C°) ül. 35^-38 C° (optimálisan 36 C) hőmérsékleten történhet. Az elkülönítés pl. az alábbi módszerek valamelyike szerint folytatiható le: 1. módszer: a mumpsz-vírust emibrionált tyúktojásokiban különítjük el klinikai anyagból (amelyet mumpsziban megbetegedett személyektől vettünk). 2. módszer: a mumpsz-vírust csirkeembriószövetkultúrában különítjük el klinikai anyagból. b) A legyengített élő rnumpsz-Jvírust tartalmazó vakcina elkészítése. A fentiek során mumpsz-vírusként azonosított vírust oly üvegpalackokba visszük be, . amelyek feb. 10 napos csirkeambriók felaprítása és tripszinnel való kezelése útján készített csirkeembrió-Jszövetkultúrát tartalmaznak. Tápközegként bármely ismert közeg alkalmazható, amelyen e sejtek fejlődni képesek; alkalmazható pl. az ismert ,,199" jelzésű táptalaj, amelyhez borjú-szérumot is adunk. A vírus hozzáadása után a fertőzött sejtkultúrákat egymást követő átvitelekben inkubáltatjuk 30—38 C° hőmérsékleten, különböző ideig; ennek folyamán a vírus szaporodik és legyengül. A vírust tartalmazó folyadékot azután begyújtjuk ás fagyasztva vagy alacsony hőmérsékleten tároljuk, a készítmény fertőzőképességének megőrzése érdiekében. Az említett sorozatos átviteleket hígított ínokulummal eszközöljük és a szaporított vírust több alkalommal, különböző időpontokban különítjük el. A termék fertőzőképességét „HeLa"' kultúra-közegben, niajom-veseszövet kultúrában vagy csitfkeembrió-szövetkultúrában titraltuk. c) A vakcina előállítása. Az 'említett sorzatos átvitelek uitán öss£egyűjtött mwmpsz-vírus nem volt patogén hatású majmokon és rágcsálókon, embereken pedig alig vagy egyáltalán nem váltott ki klinikai reakciót, ellenben jelentős mértékű antitest-képződést idézett elő. A vírus fertőzőképességét megelőző stabilizálószer, mint szacharóz, emberi albumin, glutamin, foszfát vagy ezek elegyei (hozzáadásával stabilizáljuk. A hatékonyság (megállapítását szolgáló titrálás után a vírust tartalmazó folyadékot megfelelő adagokban ampullákba töltjük és így felhasználásra kész állapotba hozzuk. A készítmény huzamosabb ideig történő tárolása fagyasztott vagy előnyösefoben fagyasztva szárított állapotban, nedvesség kizárásával történhet. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik. 1. példa: A fentebb említett 1. módszer szerint kapott inokulumot alkalmazunk. 9—11 napos csirkeembriókat a fej és a végtagok eltávolítása után aszeptikus körülmények között finoiman felaprítunk és a felaprított szöveteit többször váltott Hanks-féle BSS oldattal mossuk. A mosott szöveteket a fehérjék lebontása céljaiból 33 C° hőmérsékleten 2—3 óra hosszat oly tripszinoldattal kezeljük, amely az ismert trisz-i(hidroximetil)-aminoetán-nátriumklorid pufferoldatban oldott 0,25% tripszint (pl. Difioo 1:250 tripszinkészítmény) tartalmaz. A tripszines sejtszuszpenziót két réteg steril sajtkendőn át leszűrjük és peroenfcmt 1500 fordulattal 5 percig centrifugáljuk. Az így elkülönített sejteket tápközegben újból szuszpendáljuk számlálás céljából. Tápközegként erre a oélra „199" tápközeget alkalmazunk, amely 2% agammá borjúszérumot (56 C° hőmérsékleten 30 percig hőkezelve) és 50 giamima/íml neoanicint tartalmaz. Palack-kultúrákat készítünk, milliliterenkint 350 000 életképes sejtet tartalmazó szuszpenziőval. Ezt 48—72 óra hosszat inkufoaitatj.uk 36 C° hőmérsékleten; ezután az így kapott palack-kultúrák sorozatos átoltásokhoz vagy vakcina-készítéshez közvetlenül fel-" használhatók. A csirkeeimforiő-szovetkultúráfcat üvegpalackokban készítjük, tápközegként. 2% inaktivált borjú-szérumot tartalmazó „199" közeggel. 3 vagy 4 nap múlva a tápközeget aszeptikus körülmények között leszivatjuk és a palack-kultúrákat 100^100 ml Hanks-féle BSS oldattal négyszer mossuk. Ezután palaokonkint 2,5 ml hígított mumpsz-vírus inokulummal beoltjuk a 10 15 20 25 £0 £5 40 45 50 55 60 2