154656. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ACTH-hatású peptidek előállítására
154656 11 12 szabadalom ismerteti) és 451 mg H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-LyBí(BOC)-P:ro-Val-Lya(BOC)-Vial-Tyr-Pro-OtBu 4 ml absz. piridinnel készített szuszpenziójához 0,15 ml vizet és 0,32 ml n sósav oldatot adunk, majd az elegyet 50° hőmérsékleten 10 percig keverjük. A zavaros szuszpenzióhoz ezután 145 mg diciklohexil-karbödiimidet adunk, majd 3 óra múlva mégegyszer ugyanilyen mennyiséget adunk hozzá. Az elegyet további 3 óra hosszat keverjük 50° hőmérsékleten, majd éjjelen át 0°-on állni hagyjuk. A levált diciklohexii-karbamidot kiszűrjük és 0,8—0,8 ml 90%-os piridinnel háromszor utána mosunk. A szűredékhez 45 ml benzolt adunk, aminek hatására por alakú nyers termék válik ki, ezt szűréssel elkülönítjük és 45° hőmérsékleten megszárítjuk. Metanol, benzol és petroléter elegyéből történő átcsapással a lipofil szennyezések legnagyobb részét eltávolítjuk, majd végső tisztítás céljából Craig-megosztásnak vetjük alá a terméket metanol-tompító-kloroform-széntetraklorid 10 : : 3,17: 5:4 arányú oldószer-rendszerben (a tompító összetétele megegyezik -a 2. pont alatt megadottal), 300 fokozatban, 10—10 ml fázis-térfogatokkal. Az 51—85. elemekből (vmax = 67; K = 0,29) különítjük el szárazra történő bepárlás és az ammóniumacetát nagyvákuumban, 40° hőmérsékleten lefolytatott elszublimálása útján a terméket. Ily módon 445 mg kromatográfiailag tiszta védett tetrakozapeptid-acetátot kapunk, kb. 205—210°-on bomlás közben olvadó amorf por alakjában. A termék szilikagélen az alábbi R/^értékeket mutatja: R/ (43A) =0,63 R/ (100) =0,60 R (klorofor,m-metanol=75 : 25) = 0,42 8. H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH (D-Seri-Lys17* 18 -^-1_24-kortikotropin) szerben a termék 0,40 R/^értéket mutat. (A /^-^-kortikotropin ugyanilyen körülmények között 0,51 R/-értéket ad.) A termék 16 volt/cm feszültségeséssel, piridin-5 acetát-tompítóval beállított 6,1 pH-érték mellett végzett elektroforézis során 2 óra alatt 8,4 cm-t vándorol a katód felé. 10 2. példa: Szárazampullákba kiszerelt készítményt állítunk elő az alábbi alkotórészekből, (a megadott mennyiségek egy ampullára vonatkoznak): 15 D-Ser^Lys^'^-^-^-kortikotropin-hexaacetát 0,5 mg ZnS04 -7 H 2 0 1,23 mg Na3 P0 4 -12 H 2 0 1,38 mg mannit 40,0 mg 20 Felhasználás előtt a szárazampulla tartalmát egy oldószerampullába kiszerelt 1 ml desztillált vízzel elegyítjük. Az így kapott szuszpenzió pH-értéke 7,6. 25 3. példa: Szárazampullákba kiszerelt készítményt állítunk elő az alábbi alkotórészekből (a megadott 30 mennyiségek 1 ampullára vonatkoznak): D-Ser1 -Lys 17 ' 18 -^ 1 ~ 24 -kortikotropin-jhexaacetát 0,5 mg ZnS04 -7 H 2 0 1,23 mg 35 mannit 40,0 mg 40 45 370 mg védett tetrakozapeptid-származékot 7,4 ml 90°/o^os trifluorecetsavban oldunk és az oldatot 45 percig hagyjuk állni 25° hőmérsékleten. Ezután kb. 2 ml térfogatra bepároljuk, 20 ml vízzel hígítjuk, mégegyszer bepároljuk, 50 végül pedig liofilizáljuk. Ily módon a szabad tetrakozapeptid trifluoracetátját kapjuk, amelyet acetáttá való átalakítás céljából kevés vízben oldunk, majd egy 12,5 mm belső átmérőjű, 15 cm hosszú, gyengén bázisos ioncserélővel (pl. 55 Merck Nr. II, acetát-alakban) töltött oszlopon bocsátjuk keresztül. Az eluátumot kb. 3 ml térfogatra töményítjük be, liofilizáljuk és nagyvákuumban, 45° hőmérsékleten még utána szárítjuk. Ily módon 316 mg kromatográfiailag és 60 elektroforézis szempontjából is egységes termékként kapjuk fehér amorf por alakjában a D-Seri-Lys^s-yS^^-kortikotropin-acetátot. Az alumíniumoxidon történő vékonyrétegű kromatografálás során a (101) oldószer-rend- {55 Egy oldószerampullában az alábbi összetételű oldatot szereljük ki: Na3 P0 4 -12 H 2 0 1,38 mg Versene Fe—3 0,1 mg desztillált vízzel feltöltve 1,0 ml-re. Felhasználás előtt a szárazampulla tartalmát elegyítjük az oldószerampulla tartalmával. Az így kapott szuszpenzió pH-értéke 7,6. 4. példa: Egy ampullába az alábbi alkotórészekből álló oldatot szereljük ki: D-Seri-Lys^w-Z^-^-kortikotropin-Hhexaacetát 0,5 mg zselatin 280,0 mg fenol 5,0 mg desztillált vízzel feltöltve 1,0 ml-re. 5. példa: DSer1 -Lys 17 ' 18 -/? 1_24 -kortikotropin-hexaacetát sterilre szűrt vizes oldatát aszeptikus körülmények között elegyítjük nátrium-polifloretinfoszfáttal és nátriumkloriddal, majd ampullákba 6
