154641. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy aszpergillopeptidáz előállítására
154641 13 14 10 15 oszlopra, és újra kromatografáltuk. Az ürestérfogatnál egy 0,001 mólos foszfát-pufferral eluált kis csúcs után aszpergillopeptidáz. ARL 1 következett, és immunodiffúzióval azonosítottuk. A hozam 1,5% volt. 9. példa: Tanulmányoztuk az 5. példa szerint kapott aszpergillopeptidáz ARL 1 magatartását gélelektroforézis során. A használt készülék ismertetését lásd: Mouray H., Maretti J. és Fine J. M., Bull. Soc. Chim. Biol., 43, 943 (1961). A puffer összetétele: 1,42 g bórsav, 0,37 g nátriumhidroxid, 1 liter deionizált vízben; pH: 8,9. A hidrolizált keményítő gélelektroforézis céljára készített kereskedelmi termék volt. A keményítő koncentrációja a gélcsíkokban 15% volt. Az elektrof erogramon alkalmazott aszpergillopeptidáz ARL 1 mennyisége 0,5 mg volt 20 2,5 ,«1 deionizált vízben vagy pufferban oldva. A feszültség 35 V/cm, az elektroforézis időtartama 1 óra volt. A proteinek kimutatására elektroforézis után a csíkokat bemártottuk egy 0,1 g amidfeketét, 25 45 ml glicerint, 45 ml vizet és 10 ml ecetsavat tartalmazó fürdőbe. A csíkokat a glicerin-víz-ecetsav elegyben néhány óra hosszat mostuk. A proteolitikus hatás megoszlását az elektrof erogramban a gélcsíkoknak 2 mm széles szeletekre való szétvágása útján állapítottuk meg. A csíkokat próbacsövekbe raktuk 3 ml 0,2 n 6,0 pH-jú foszfátpuffert adtunk hozzá, majd a csíkokat égy keverőben szétoszlattuk. A proteolitikus hatást az egyes csövekben a kazeináz módszerrel! [Bergkvist, R.: Acta Shem. Scand. 17, 1521 (1983)] határoztuk meg. 30 35 ben újra szuszpendálva kimostuk. A centrifugálást megismételtük 12 percig 250Xg-nél. Vé>gül a lemezkéket trisszel pufferolt sóoldatban (0,154 mól nátriumklorid és 0,154 mól triszpuffer 7,4 pH-nál 9 :1 arányban) szuszpendáltuk, és kb. 500 000 lemezke/cm3 ' koncentrációt kaptunk. Ilyen lemezkeszuszpenziókat jégen tartottunk el legfeljebb 5 óra hosszat. A vizsgálatra 3,0 ml ilyen szuszpenziót vittünk be egy szilikónozott Klettsummerson koloriméterbe. A keverést szilikónozott üvegrúddal végeztük, amelyet 1000 fordulat/perc sebességgel egy szinkron motor forgatott. A leolvasásokat, minden percben 620 m,«-nál végeztük. Előbb 4,5 perces ellenőrző menetet tartottunk minden adalék nélkül. Hígulás elkerülésére a szükséges adalékokat 10 /«l-es térfogatokhoz adtuk. Kalciumionokat kalciumklorid oldat alakjában adalékoltunk, a végső koncentráció a vizsgált mintában 1,1 millirnól volt. Hasonlóképpen adagoltunk ADP-t 8 ,«g/m.l koncentrációig. 0,001 és 0,01 «g A enzimkeverék/ml szuszpenzió hatását 10 perccel az ADP előtt adva összehasonlítottuk egy kontroll mintáéval, amelyben sólevet használtunk az enzim helyett. Az eredményeket alább közöljük, a számok maximális tömörülést mutatnak 15 perccel az ADP adagolás után: •. Adalék •• . % tömörülés kontroll (Ca+ /,.ADP 61 A enzimkeverék 0,001 ,«g, Ca++ S ADP 2 A enzimkeverék 0,01 ,«g, Ca++, ADP 5 A proteolitikus aktivitás összeesett az elektroferogram színezett területével. Csupán egy színezett területet lehetett kimutatni. A távolság, amennyire az aszpergillopeptidáz ARL 1 elvándorolt, 2,0—2,5 cm volt a negatív pólus felé. Az alábbi példák szemléltetik az aszpergillopeptidázok vérlemezkék ragadósságára és tömörülésére gyakorolt hatásának tanulmányozására használt módszert. 10. példa: Az egyik nyaki verőérbe szúrt műanyag injekciós tűvel vért vettünk egy éterrel elkábított nyúltól. A vett vért egy műanyag centrifugacsőben azonnal összekevertük 0,075 térfogat 7,4 pH-ra beállított 0,077 mólos nátríumetiléndiamintetraacetát oldattal. Minden további műveletben szilikónozott üvegedényeket használtunk. A vért hűtött centrifugában (5 C°) 12 percig centrifugáltuk 250X,g-nél, a vörös vérsejtek eltávolítására. A vérlemezkéket tartalmazó folyadék felső háromnegyed részét ismét centrifugáltuk, mire a vérlemezkék leülepedtek. Az üledéket 0,154 mól nátriumklorid, 0,154 mól 7,4 pH-jú trisz-hidroklp-ridpuffer és 0,077 mól etiléndiamintetraacetát 90 : 8 : 2 arányú keverék-40 45 50 55 60 11. példa; Vérlemezkeszuszpenziót készítettünk a 10. példában leírt módon. Etiléndiamintetraacetátot adtunk a szuszpenzióhoz 1,5 millirnól koncentrációig. 0,001, 0,01 és 0,1 ;«g/ml szuszpenzió A enzimkeverék adagokat inkubáltunk a lemezkékkel 5 percig szobahőmérsékleten, majd a lemezkéket kicentrifugáltuk, egyszer mostuk, és a 10. példában leírt módon ismét szuszpendáltuk. Kontroliképpen egy szuszpenziómintát ugyanilyen módon kezeltünk azzal a különbséggel, hogy elhagytuk az enzimet. A kalciumionokat és az ADP-t 5 perccel a mintáknak a koloriméterbe való behelyezése előtt juttattuk be. 65 Adalék kontroll (Ca++ ADP) A enzimkeverék 0,001 y/ml, Ca++ ADP A enzimkeverék 0,01 y/ml, Ca++ , ADP A enzimkeverék 0,1 y/ml, Ca++ , ADP % tömörülés 52 2 15 15 7
