154641. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy aszpergillopeptidáz előállítására

154641 8 verés után a keveréket szobahőmérsékletén 30 percig állni hagytuk, majd centrifugáltuk. A kicentrifugált folyadékot ezután gyapoton átszűrtük; A tiszta szűredék extinkeióját Zeiss spektrofotométerrel mértük 280 m." hullámhossz- 5 nál. Az aszpergillopeptidáz ARL 1 pH optimumát 5,0—5,5-nek, a proteáz I-ét kb. 7,0—7,5-nek találtuk. Az aszpergillopeptidáz ARL l-nek az aktivitását szintetikus szubsztrátumokkal, nevezetesen 10 nátrium-tozil-L-arginin-etilészterrel és N-acetil-L-tirozin-etilészterrel szemben egy pH-stat-tal (Radiometer model SBR 2/SBU 1/TTT 1) vizsgáltuk. A kísérletet 30 C°-on és 7,4 pH-nál hajtottuk végre. 0,05 mólos nátronlúgot használ- 15 tunk reagensként, ami megfelel 0,25 mikromól savképződés érzékenységnek a műszer 1 osztásrészére. Az egyik vizsgálati oldat 0,5 millimól nátrium-tozil-L-arginin-etilésztert és 0,2 mg enzimet tartalmazott 10,0 ml vízben, a másik vizs- 20 gálati oldat pedig 0,1 millimól N-acetü-L-tirozin-etilésztert és 0,2 mg enzimet 10,0 ml 10°/<ros etanolban. 10 percen belül nem lehetett kimutatni a vegyületek hidrolízisét. Érdemes megjegyezni, hogy a két vegyület jó szubsztrátum 29 proteáz I számára. Az aszpergillopeptidáz ARL 1 ultraibolya színképe jellemző az aromás aminosavakat tartalmazó proteinekre, a termék jól oldódik vízben, sóoldatban és pufferoldatokban. Száraz 30 porként több mint egy évig állandó enzimes hatékonyságának, azaz vérlemezkék ragadósságát és tömörülését megakadályozó képességének elvesztése nélkül. Hasonlóképpen vizes oldatai állandók 4 C°-on hónapokig és 37 C°- 35 on több mint 24 óra hosszat enzimes aktivitásuk elvesztése nélkül. Meghatároztuk a proteáz I és az aszpergillopeptidáz ARL 1 intravénás toxicitását. Az LD50-et him fehéregereken 17,5, illetve 9,5 4C mg/kg testsúlynak találtuk. Mai ismereteink szerint az ADP (adenozindifoszfát) döntő szerepet játszik a vérlemezkék ragadási és tömörülési mechanizmusában, és ezért kulcshelyzetet foglal el olyan folyamatok- 45 ban, mint a trombózis. Az ADP-nek ez a tulajdonsága in vitro is kimutatható különféle eljárásokkal, ezek némelyike alkalmas az ADP hatást zavaró anyagok tanulmányozására is. Így két in vitro rendszerben tanulmányoztuk az A 50 enzimkeverék befolyását nyúl vérlemezkéinek az ADP keltette tömörülésére. Az egyik rendszerben a vérből centrifugálással és mesterséges közegben való szuszpendálás- 55 sal elkülönített mosott lemezkéket használtunk. A másik rendszerben a lemezkéket természetes környezetükben — a plazmában — hagytuk, a vörös vérsejteknek centrifugálással való eltávolítása után. Mindkét rendszerben a zavaros- 60 ság vagy az optikai sűrűség változásaként regisztráltuk ADP hozzáadása után a tömörülést, és megfigyeltük, hogy hogyan módosítja az aszpergilloproteáz-készítmény előző hozzáadása in vitro az ADP-re való reagálást. 65 Egy harmadik használt módszerben az aszpergilloproteázt in vitro hozzáadás helyett az állatba fecskendeztük vérminták gyűjtése és lemezkékben dús plazma készítése előtt. Többször az enzim befecskendezése előtt fotometriailag meghatároztuk a lemezkék; tömörülését az ADP hozzáadásának hatására, és minden változást az előkezelési értékekhez képest a beadott enzimnek tulajdonítottunk. Pufferolt sóoldatban szuszpendált mosott nyúl-vérlemezkék használata esetén az ADP kalciumionok hozzáadására a lemezkék jelentős tömörülését okozta. A folyamat időbeli menetét az optikai sűrűségnek 1 percnyi időközökben való leolvasásával követtük. Azt találtuk, hogy kb. 10 perc elmúltával volt a legnagyobb a tömörülés, és nem figyeltünk meg további növekedést később sem. Á 15. percben észlelt (meghatározott kalcium és ADP koncentráció által kiváltott) maximális tömörülési értékeket összehasonlítva azt találtuk, hogy A enzimkeverék-T^készítmények kis koncentrációban (10"'—10-5 /ig/ml) való előzetes hozzáadása hatásosan gátolja az ADP hatását. E hatásnál rövid látens időszak mutatkozott, de az egyszer létrejött gátlást nem fokozta a hosszabb előinkubáció. Az ADP okozta tömörülés gátlására nincs szükség kalciumionokra, ami kitűnt abból, hogy a gátlás létrejött a kalciumot kelátkomplexként hatásosan megkötő etiléndiamintetraecetsavat tartalmazó közegben is. Az enzim e gátló hatásának további jellemzőjeként megfigyeltük, hogy ha egyszer érvényre jutott, az enzimmel kezelt vérlemezkék ismételten moshatók voltak anélkül, hogy elvesztették volna az ellenállásukat hozzáadott ADP-vel szemben. Amikor A enzimkeveréket adtunk in vitro plazmában szuszpendált mosatlan lemezkékhez, kitűnt, hogy ez az enzimkészítmény is ellenállóvá tesz további ADP adagokkal szemben, bár a szükséges koncentrációk lényegesen nagyobbak voltak, mint a fent említett rendszerben. Egy rövid látens időszak az enzim hatásában ebben a rendszerben is mutatkozott. Amikor az A enzimkeverék-készítményt intravénásán adtuk az állatnak, annak hatása az ezt követően vett lemezkékben dús plazmaminták ADP okozta tömörülésére csak a beadás után 24—48 órával volt megfigyelhető. A látens időszakra vonatkozó in vivo és in vitro észleletek e különbözőségének az okát nem ismerjük. Az ADP okozta tömörülés gátlása, ha egyszer beállt, 3—4 napig fennmaradt. A gátlás a készítmény ismételt befecskendezésével meghosszabbítható volt. Az enzimkészítmények az emberekre való hatását is tanulmányoztuk, eddig 28 betegen, közülük egyeseknek normális, a legtöbbnek azonban patologikusán megnövekedett volt a tömörülési értéke (normális érték 37%). A tömörülést úgy határoztuk meg, hogy a plazmamintákat reprodukálható aggregáló hatásnak tettük ki meghatározott időre, majd a plazmamintákat megszűrtük. A trombocitás számát elekt-4