154641. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy aszpergillopeptidáz előállítására

9 :. " ronikusan megszámoltuk a művelet előtt és után. [A műveletet részletesen leírja Jürgens: J. Life Sciences 7, 1379—1387 (1966)]. A különbség a tömörülés mértéke. Az összetömörült trombociták számát az eredeti szám százalékában 5 jezzük ki, ezt az alábbiakban tömörülési értéknek nevezzük. Az A enzimkeverék-készítményeket lassú intravénás injekció vagy intravénás infúzió alakjában alkalmaztuk. Azt találtuk» hogy 120—150 mg enzimkészítmény beadása 10 határozottan csökkenti a lemezkék tömörülését. Egyes esetekben már 60 mg-os adag elég volt a kívánt hatás kiváltására. Az adagnak 180—200 mg-ra való növelése meghosszabbította a hatást. Például 150 mg-nak 4—6 naponként való isme- 15 telt beadásával igen kis tömörülési értékeket sikerült elérni nagyon hosszú időre. Ezekben a kísérletekben a készítményt igen jól tűrték komoly mellékhatás nélkül. Amikor aszpergillopeptidázokat használnak a 20 gyógyászatban trombusdk és embolusok képződésének megakadályozására, ezeket lassú intravénás injekció vagy intravénás infúzió alakjában kell alkalmazni. Kb. 1—2 súly% aszpergillopeptidáz ARL 1-et "tartalmazó enzimkeverék 25 használata esetén (száraz porra számítva) az adag általában 50 és 200 mg között változik, ezt az adagot 4—6 naponként adhatjuk be tartós hatás létrehozására. Az adagolás és a beadások közötti időtartam a betegre gyakorolt hatástól 30 függ. Az'elkülönített aszpergillopeptidáz ARL 1 és ARL 1-et tartalmazó enzimkeverékek közötti mennyiségi összehasonlító vizsgálatok még nem fejeződtek be, de az ARL 1 a kívánt hatást sokkal kisebb koncentrációknál mutatja, mint az 35 enzimkeverékek. Az alábbiakban a találmányt részletesebben ismertetjük a készítmények előállításának és tulajdonságainak, továbbá állati vérre és az emberre gyakorolt hatásuknak szemléltetésével, 40 az utóbbit a mellékelt grafikus rajzokon is bemutatjuk, ezek az A enzimkeverék intravénás infúziójának hatását mutatják emberen a spontán lemezketömörülés (A) %-aban kifejezve a beadástól eltelt idő (T) függvényében; a beadás 45 pillanatát nyíl jelzi. A rajzon az 1. és 2. ábra szemlélteti egyetlen 120, illetve 150 mg-os intravénás adag hatását 3 betegre, 50 a 3.-ábra pedig 150—150 mg-os ismételt intravénás adagok hatását egy betegre. 1. példa: 55 Aspergillus oryzae folyékony tenyészetéből származó csersavval kicsapott 85 g proteáz keveréket 29 g nátriumacetáttal együtt feloldottunk 725 ml vízben, és a pH-t nátronlúggal beállítottuk 6,5-re. A szuszpenziót 45 percig 60 kevertük, majd hozzáadtunk 8,5 g dibenziletiléndiaminacetátot, és a rendszert centrifugáltuk. A kicentrifugált anyagot 150 ml vízzel mostuk, és ismét centrifugáltuk. A két centrifugálásból származó oldatokat egyesítettük, és 18 g Celit gs 10 (kovaföld) szűrést elősegítő anyagként való hozzáadása után leszűrtük. A kapott 990 ml szűredéket 17 óra hosszat 85 liter vízzel szemben dializáltuk, majd felhígítottuk 1700 ml-re. Az oldat pH-jának ecetsavval 5,5-re való beállítása után hozzáadtunk 255 g ammóniumaeetáttaJ egyensúlyba hozott karböximetilcellulózt. Azí enzimeket adszorbeálva tartalmazó karböximetilcellulózt elkülönítettük, és háromszor 1700 ml 5,5 pH-jú vízzel mostuk. Ezután a karböximetilcellulózt egymást követően külön-külön 640— 640 ml vizes 0,005 mólos ammóniumacetáttal, 0,01 mólos ammóniumacetáttal újra, 0,01 mólos ammóniumacetáttal,: és. 0,1 mólos ammóniumacetáttal 7,5 pH-nál kezeltük. Minden kezelés előtt a rendszert szűrést elősegítő anyagként 5 g Celittel szűrtük. A szűredékekét különválasztva liofilizáltuk. Minden kezeléssel száraz por készítményt kaptunk, fokozatosan növekvő aszpergillopeptidáz ARL 1 tartalommal. A száraz por mennyisége azonban fokozatosan csökkent. A kapott első A enzimkeverék-készítményben az aszpergillopeptidáz ARL 1 koncentrációja kb. 1% volt. A negyedik készítményben 40—60% között változott. A teljes anyagmennyiség a négy készítményben kb. 2,6, 1,3, 0,36 és 0,59 g volt. Ha ammóniumacetát oldat helyett foszfáttal pufferolt oldatot használunk, a szűredékeket alaposan dializálni kell liofilizálás előtt, ami jelentős aszpergillopeptidáz ARL 1 veszteséggel jár. 2. példa: Aszpergillopeptidáz ARL 1 és a , Bergkvist által leírt [Acta Chem. Scarid. 17, 1521 (1963)] 3 proteáz (I, II, III) egyenlő arányú keverékéből 0,4 g-ot feloldottunk egy pufferoldátban, és felvittünk egy 0,005 mólos foszfát-pufferral 6,0 pH-nál egyensúlyba hozott 3,9 x 40 cm méretű dietilaminoetilcellulóz oszlopra. Az eluálást egymás után 0,005, 0,10, 0,25 és 0,5 mólos foszfátpuffer oldattal végeztük. Az aszpergillopeptidáz ARL 1 jelent még elsőnek, de tökéletlenül elválasztva a pröteáz I-től, amikor 0,005 mólos pufferral eluáltunk. A proteáz Il-t a 0,10 mólos puffer, aprotéáz III-t/0,15 mólos puffer eluálta. 3. példa: Négy 17—20 cm magas és kb. 1 cm átmérőjű hidroxilapatit oszlopot használtunk [a hidroxilapatitot Tiselius, A. és munkatársai: Arch. Biochem. Biophys. 65, 132 (1956) szerint készítet-, tük]. Miután az oszlopokat 0,001 mólos foszfátpufferral 6,80 pH-nál egyensúlyba hoztuk, a kiindulási anyagot, 30 mg A enzimkeveréket (az 1. példában használthoz hasonlót) vittünk fel minden oszlopra. Az A enzimkeveréket előzőleg dietilaminocellulózon 6,0 pH-nál 0,025 mólos ammóniumacetáttal kezeltük, majd feloldottuk 3 ml puff erben. A hidroxilapatitról a pufferral eluáltuk, és az eluátumot kb. 3 ml-es frakciók*