154641. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy aszpergillopeptidáz előállítására
154641 S 6 lökön, amilyen az amberlit CG:50 II, 0,01 mólos foszfátpuffer jelenlétében 7,5 pH-nál. Az A enzimkeverék fő összetevőjéhez képest (proteáz I) az aszpergillopeptidáz ARL 1 erősebben ad-5 szorbeálódik mind a mesterséges, mind a cellulózból származó savas ioncserélőkön. Az* aszpergillopeptidáz ARL 1 nehezebben eluálódik az A enzimkeverék egyéb összetevőinél harántkötésű gélszűrő anyagok oszlopáról kromatográ-10 fiai úton való eluálás során; pl. Sephádex (G:50, G:75 vagy G:100) (Dextrán alapú készítmény gélszűrésre) oszlopokról. Lehetségesnek bizonyult a proteáz I teljes elválasztása az aszpergillopeptidáz ARL 1-től. Ebből a visszatar-15 tásból arra lehet következtetni, hogy az aszper. gillopeptidáz ARL * 1 molekulasúlya kisebb 20 000—30 000-nél, a proteáz I ultracentrifugálással meghatározott molekulasúlyánál. Azonkívül azt találtuk, \hogy az aszpergilíopeptidáz 26 ARL 1 visszatartódik Sephádex G:5Ö Fine-en a glukóz eluátumának és az 5-105 molekulasúlyú Dextrán eluátumának térfogatai közötti különbség kb. 30%-áig. Ez az utóbbi gél visszatartja a 8000—10 000-nél kisebb molekulasúlyú 25 Dextrán-molekulákat Keményítőgél-elektroforézisben az aszpergillopeptidáz ARL 1 egyetlen széles csúcsként vándorol 2,0—2,5 cm/h mobilitással 35 V/cm-nél 0,1 mólos 8,9 pH-jú borátpufferban. Az A enzim-30 keverék fő csúcsának mobilitása azonos körülmények között 0,5—0,8 cm volt. A vándorlás mindkét esetben a negatív pólus felé irányult. Az aszpergillopeptidáz ARL 1 aktivitását kazeinnel szemben egy Bergkvist által leírt mód-35 szerrel határoztuk meg. A kazeint Johnson Lindsay-pufferral pufferoltuk. (Bergkvist, R. idézett hely). 7,4 pH-nál a hidrolízist egyenesen arányosnak találtuk a jelenlévő enzim mennyiségével 0,3 mg-ig. Aszpergillopeptidáz ARL 1 40 0,1 mg mennyiségben kazeinnel 6,85 pH-nál 20 percig 37 C°-on inkubálva 0,170 optikai sűrűség növekedést mutat. tított oldatát 4 és 6 pH között rávisszük egy gyengén savas ioncserélőre; b) 6—8 pH-ra pufferolt eluáló oldatot átbocsátva az ioncserélőn eluáljuk az enzimeket; c) az így kapott enzimkeveréket gélszűréssel, frakcionált kicsapással, adszorpciós kromatografálással, ioncserélő kromatografálással, elektroforézissel vagy dialízissel vagy ezeknek a műveleteknek a kombinálásával tovább tisztítjuk, amíg csak meg nem kapjuk az aszpergillopeptidáz ARL 1 enzimkészítményt, amely újra feloldva vagy adott esetben megszárítva és újra feloldva egy injektálható közegben olyan oldatot szolgáltat, amellyel egy 0,1—10 mg-os, előnyösen 0,5—7 mg-os, legelőnyösebben 1—i mgös aszpergillopeptidáz ARL 1 adag fecskendezhető be. • Közegként általában legelőnyösebb a víz, amelyet izotónikussá tehetünk pl. nátriumklorid, glukóz vagy fruktóz hozzáadásával. Olyan esetekben, amikor más gyógyszerek alkalmazása is indikált, ezeket az injekciós oldatokhoz adhatjuk, feltéve, hogy azokkal összeférnek. A fenti lépések végrehajtása során természetesen a műveleti körülményeket — miként ez a gyakorlott szakmunkás előtt nyilvánvaló — az aszpergillopeptidáz ARL 1 tulajdonságainak figyelembevételével úgy kell megválasztani, hogy elősegítsük annak feldúsulását vagy elkülönülését. Az alább közölt példákban említett A enzimkeverékekben az új enzim arányát a száraz porra számítva 1 súlyO/^-nak találtuk. Aszpergillopeptidáz ARL l-ben jelentősen dúsabb készítmények nyerhetők, ha az Aspergillus oryzae folyékony tenyészetéből csersavval vagy ligninnel kicsapott nyers proteáz keveréket (lásd Bergkvist, R. idézett hely) 5,5 pH-nál karboximetílcellulózzal keverjük, és az ezt követő eluálást pl. kb. 0,005 mól vagy ennél kisebb koncentrációtól 0,01^0,1 mól koncentrációig (az utóbbi nagyobb, mint a Bergkvist által használtak) fokozatosan növekvő koncentrációjú pufferekkel végezzük. A legelőnyösebb eredményeket olyan karboximetílcellulózzal érhetjük el, amely a karboximetilcellulóz grammjára számítva 0,7—0,9 milliegyenérték karboxicsoportot tartalmaz. Az ARL 1 töménysége változtatható annak a pH-nak a változtatásával, amelynél az enzimeket a karboximetikellulózon adszorbeáltatjuk. Ezenkívül bizonyos szintetikus ioncserélőket is felhasználhatunk, pl. polisztirolon és poliakrilamidon alapulókat karboximetilcellulóz helyett az aszpergillopeptidáz ARL arányának növelése céljából. A találmány szerinti új enzim száínbavehető adszorbció nélkül áthalad egy kalciumfoszfát oszlopon 6,80 pH-nál 0,001 mól foszfátpufferkoncentráció használata esetén. Ez a viselkedés jellemző kis molekulákra, amilyenek a peptidek, valamint semleges és egyes bázikus molekulákra [Tiselius, A. és mások: Arch. Biochem. Biophys 65, 132 (1956)]. Az aszpergillopeptidáz ARL 1 adszorbeálódik gyengén savas ioncseré-Az aszpergillopeptidáz ARL 1 hatását fibrinre Dyer és Kadar módszerével mutattuk ki [Dyer, A. E. és Kadar, D: Blood 23, 729 (1964)]. Ezt a módszert használtuk a diizopropilfluorfoszfát okozta inhibició vizsgálatára is. Mind az aszpergillopeptidáz ARL 1, mind a proteáz I inhibitálódott. E tekintetben az aktív helyeiken a szerin aminosavat tartalmazó enzimekhez, pl. tripszinhez és kimotripszinhez hasonlítanak. Az aszpergillopeptidáz ARL 1 pH-optimumát hemoglobinnal szubsztrátumként meghatároztuk és összehasonlítottuk a proteáz I-ével. lOOy aszpergillopeptidáz ARL 1-et egy 1 mg/ml-t tartalmazó törzsoldatból átvittünk egy sorozat próbacső mindegyikébe, amelyek 2 ml különböző pH-jú, 37 C°-os fürdőben egyensúlyba hozott hemoglobinoldatot (készült Glick, D. szerint — Methods of Biochemical Analysis II, p. 248) tartalmaztak. 37 C°-on való 10 perces inkubálás után 1 ml^es mintát vettünk ki a próbacsőből, és amilyen gyorsan csak lehet, hozzáadtuk 4 ml 5%-os triklórecetsav oldathoz. Alapos ke-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 eo 3
