154246. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1,2-dehidroszteroidok előállítására
5 154246 tatív papírkromatográfiával is meghatároztuk a következő módon: A fermentátum betöményített extraktumának mért hányadából 50—100 ./d-t cseppentettünk fel előzetesen túlfolyó kromatogram alakjában etilalkohollal mosott Macherey—Nagel 214-jelű papírra, melyet a felcseppentés előtt 30% propilénglikolt tartalmazó metilalkohollal impregnáltunk. Mobil fázisként propilénglikollal telített széntetraklorid és metiiciklohexán 1:1; arányú elegyét használtuk. A polárosabb szteroidok szótkromatografálására impregnálóként etilénglikolt, mobil fázisként etilénglikollal telített széntetraklorid és diklóretán 1 :1 arányú elegyét tartalmazó rendszert használtunk. Az elválasztás után a szteroidokat ultraibolya kontaktfotóval kimutattuk, a megfelelő kivágott papírrészből a szteroidokat 10 ml p.a. tisztaságú alkohollal eluáltuk, majd az eluátum extinkcióját 242 m/i-nál megmértük. A megfelelő vakérték levonása után standard görbéből leolvastuk az oldat szteroid-tartalmát. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa: Corynebacterium equi egyhetes burgonyás ferdeagaron nőtt tenyészetéből 3 ml steril desztillált vízzel szuszpenziót készítettünk és ebből 1 ml-rel oltottunk 100 ml KA12 jelű steril táptalajt 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokban. A beoltott lombikokat 28 C°-os termosztát szobában rázatva inkubáltuk 48 óra hosszat. A kapott tenyészet (a továbbiakban „KA12 " tenyészet) 100 ml-éhez 20 mg hidrokortizont adagoltunk 2 ml 10%-os CaCl2 -t tartalmazó MeOH-ban oldva. A lombikot 28 C°-on tovább rázattuk. Az oxidáció előrehaladását tioszemikarbazonos módszerrel mértük. Az eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze: 1. táblázat Tenyészet kora Hidrokortizon Prednizolon órákban /«.g/ml /^g/ml 10 15 20 25 30 55 40 45 0 1 2 3 4 10 170 90 10 0 0 0 20 100 180 170 160 20 50 lű táptalajt 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokban. A beoltott lombikokat 28 C°-os termosztát szobában rázatva inkubáltuk 48 óra hosszat. Az így nyert tenyészethez {a továbbiakban CSp tenyészet) az 1. lombiknál a tenyészet eredeti töménységében, a 2. lombiknál a tenyészet steril desztillált vízzel történő 10-szeres hígítása után 100 nőienként 20 mg hidrokortizont adagoltunk 2—2 ml CaCl2 -es MeOH-ban. Ezután a lombikokat tovább inkubáltuk a 28 C°-os termosztát szobában rázatva, és az oxidációt kromogénes prednizolon meghatározási módszerrel követtük. Eredményeinket a 2. táblázatban foglaltuk össze. A táblázat adataiból látható, hogy a hidrokortizon dehidrogénezése a 3. órára teljessé válik, a további inkubáció a szteroid lebomlását eredményezi. 2. példa: Corynebacterium equi egyhetes, burgonyás ferdeagaron nőtt tenyészetéből 8 ml steril desztillált vízzel szuszpenziót készítettünk és ebből 1—1 ml-rel oltottunk 100—100 ml steril CSp je-2. táblázat Tenyészet 1. lombik 2. lombik kora Prednizolon Prednizolon órákban /tg/ml fig/ml 0 35 25 1 105 38 2 175 50 4 100 85 6 50 115 8 0 165 12 0 170 A 2. táblázat adatai mutatják, hogy a tényé-, szét hígításával a dehidrogénezés és a prednizolon-lebontás sebessége közti különbség jelentősen növelhető, és így lehetővé válik a hasznos termék maximális koncentrációban való jelenlétekor a fermentáció leállítása. 3. példa: Kétnapos Csp tenyészetet desztillált vízzel tízszeresére hígítottunk, majd az 1. lombiknál 20 mg hidrokortizont, a 2. lombiknál 20 mg hidrokortizont és 3 mg klorocidot adagoltunk CaCl2 -os MeOH-ban. Inkubálás és analitikai követés a 2. példában leírtak szerint történt. Az eredményeket a 3. táblázatban közöljük: 3. táblázat 55 60 Tenyészet 1. lombik 2. lombik kora Prednizolon Prednizolon órákban /tg/ml /xg/ml 0 20 20 4 130 120 8 160 150 12 140 180 65 A táblázat szerint 30 /tg/ml klorocid jelenléte nem befolyásolja a Corynebacterium equi A1 -dehidrogenáz-akti vitását. 3
