153664. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ACTH-hatású peptidek előállítására

31 153664 32 lárdult raakcióelegyet 8 ml benzollal hígítjuk és homogenizáljuk, szűrjük és 10:1 benzol-metanol eleggyel mossuk. Nagyvákuumban 50° hőmérsékleten szárítva kapjuk a tiszta tetrapeptidnhidrazidot, amely 190°-on bomlás közrben olvad. Ez a termék szilikagélen vékonyrétegű kromatografálással az alábbi R/-értékeket mutatja: R/ (kloroform-metanol -85:15) = 0,21 R/ (100) = 6,85. g) Z-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lysi(BOC)-Lys(BOC)-ArgnArg-Pro-Vál-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro(OtBu)-triacetát 625 mg {0,273 millimól) H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lysl(BOC)JLys(BOC)HArg-Arg-PTO-V;al-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-1

(0tBu)-triaicetátot 10 ml száraz piridinben 0,17 g p-toluolszulfonsavval elegyítünk. A kapott oldatot szárazra pároljuk be, a maradékot 0,01 mm, Hg-oszlop nyomás alatt 35° hőmérsékleten mentesítjük a piridinacetáttól, majd a piridintozilátot aoetonnal való eldörzsölés és leszivatás útján eltávolítjuk. Ilymódon 72.6 mg védett tetradekapeptid-tritozilátot kapunk, 155'—162 °-on olvadó színtelen por alakjában. 525 mg (0,2 millimól) fenti tritozilátot és 345 mg (0,24 millimól) Z-Glu{OtBu)-His-Phe-A^g-Try-Gly-OH-t (előállítva Z-Arg-OH és H-Try-Gly-OCH3

kondenzációja, a tripeptidszármazék karbobenzoxi-esoportjának lehasítása, a szabad tripeptidészter és Z-Phe^OH ko'ndenzációjia, a kapott tetrapeptidészter karbobenzoxi-csoportjánák lehasítása, a szabad tetrapeptidészter és Z-Glu{OtBu)-His-N3 kondenzációja és a metilészteresoport n-nátriumhidroxidoldattal 7;

5%-os dioxániban történő elszappanosítása útján) 4 ml '80%-os piridinben oldunk keverés közben 50° hőmérsékleten. A kapott tiszta oldathoz 52 mg (0,i25 millimól) diciklohexilkarbodiimidet adunk. Az elegyet 20 óra hosszat '50° hőmérsékleten tartjuk, majd a kapott gyengén zavaros oldatot 10°-ra hűtjük le és a levált dieiklohexilkarbamidot leszűrjük. A szüredékíhez nagymennyiségű étert adunk, amikoris az eikozapeptid tritozilátja leválik. Ezt a terméket elkülönítjük, 10 ml 60%-os metanolban oldjuk és egy 4 ml Amberlite IRA-400 ioncserélő-gyantát acetát-alakban tartalmazó oszlopon kromatografáljuk. Az eluátumot vákuumban bepároljuk és éterrel eldörzsöljük. Ilymódon 650 mg nyers védett eikozapeptidészter-triacetátot kapunk. Ez a termék vékonyrétegű kromatografálással az alábbi R/értékeket mutatja: alumíniumoxidon: R/ (100) = 0,34 szilikagélen: R/ (101) = 0,76 R/ (110) = 0,45. Előhívás: Reindel—Hoppe-, Pauly- és Ehrlich-reagenssel. A védett eikozapeptidésztertriacetát mellett reagálatlan hexapeptid- és tetradekapeptid-származékot, valamint több gyorsabban migrálő mellékterméket is találunk. 5 h) H-Glu(OtiBu)-HisHPhe^Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys!(BOC)-Arg-Arg-PTO-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Proi(OtBu) -tetraacetát 10 600 mg nyers eikozapeptid-származékot 10 ml metanolban oldunk és 0,5 ml jégecet hozzáadásával, 1 g 10%-os palládiumos aktívszén katalizátor jelenlétében éjjelen át hidrogénez-15 zük. Ezután a katalizátort kiszűrjük és a szüredéket vákuumban bepároljuk. A kapott dekarbobenzoxilezett terméket 10 ml terc.butanol-víz {1:1) elegyben oldjuk és egy 6 g karboximetilcellulózt tatralmazó oszlopon kroma-20 tografáljuk, 100 ml j

50%-os terc.butanol és 100 ml 50%-os terc.butanol — jégecet (9:1) közötti gradiens alkalmazásával. A vékonyrétegű kromatográfiai vizsgálat szerint egységes eikozapeptid-származékot tartalmazó frakciókat egye-25 sítjük és vákuumban ibepároljuk. Az így kapott védett eikozapeptidészter-tetraacetát szilikagélen kromatografálva az alábbi R/-értékeket mutatja: £0 R/ (54) = 0,50 R/ (101) = 0,68 R/ (110) = 0,12. Az összes védőcsoportokat 90%-os trifluor-S5 ecetsavval lehasítva kapjuk a szabad eikozapeptidet, amelynek R/-értékei: szilikagélen R/ (101) = 0,25 alumíniumoxidon R/ (101) = 0,30. 40 i) BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-«Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-LysiíBOQ-LysíBOCJ-Arg-Arg-Pro-Val-Lys{BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu 45 10i2 mg BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-hidrazidot 0,7 ml absz. dimetiMormamidban oldunk és az oldatot 0° hőmérsékletre hűtjük le. Ezután 0,156 ml 4,12 n sósavoldatot adunk hozzá és 50 azonnal lehűtjük —10°-ra. 0,036 ml 5 n nátriumnitritoldatot adunk hozzá, majd —10° hőmérsékleten 10 percig reagálni hagyjuk, azután hozzáadjuk 298 mg H-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys-55 (BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro(OtBu)-tetraacetát és 0,12 ml trietüamin 1 ml absz. dimetilformamiddal készített és 0° hőmérsékletre előzetesen léhűtött oldatát. Az elegyet 0°-on ,24 óra hosszat állni hagyjuk, majd 60 bepároljuk, és a kapott olajszerű maradékhoz 10 ml vizet adunk. A levált kondenzációs terméket leszűrjük és nagyvákuumban 40° hőmérsékleten megszárítjuk. Ezt a terméket tisztítás céljából metanol-55 -puffer-kloroform-széntetrakloTid 32:16:21:9 ol-16 t