153664. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ACTH-hatású peptidek előállítására
27 153664 28 párlása útján gyakorlatilag "tiszta állapotban kapjuk a védett hexadekapeptid-származékot Ez a termék szilikagél-lemezeken történő vékonyrétegű kromatografálás során az alábbi R/-értéket mutatja: 5 R/ (101) = 0,80. c) H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH^-acetát 10 20 mg fenti módon kapott tisztított hexadekapeptid-származékot 1 ml 95%-os trifluorecetsavoldatban oldunk és az oldatot 24° hőmérsékleten 1 óra hosszat állni hagyjuk. Ezután az oldatot szárazra pároljuk be és a maradékot híg ecetsavban oldjuk. Az oldatot acetát-alakban levő gyengén bázisos ioncserélőgyantával (Merck Nr. II) töltött oszlopra viszrszűk, a triífluoraoetát-ionok acetát-ionokra való kicserélése céljából. Az. eluátumot liofihzáljuk; ilymódon 15 mg szabad hexadekapeptid-amidot kapunk színtelen por .alakjában. Ez a termék aluminiumoxid-lemezeken történő vékonyrétegű kromatografálás során az alábbi R/-értéket mutatja: R/ (101) = 0,6. Az így kapott D-Ser1 -béta 1_6 -i kortikotropin-amid számottevő kortikotrop' aktivitást mutat Sayer-próba során, míg a megfelelő L-Ser1 -béta' ~J 6 -kortikotropin úgyszólván semmi hatással nem rendelkezik. 6. példa: a) BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Gluí(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys((BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-Asp(OtBu)-Gly-Ala-Gliu(OtBu)-Asp-(OtBu)-Glu(NH2)-Leu-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu ráfiai módszerrel vizsgált, védett béta-kortikotropin-tartalmú frakciókat (50—80. frakció) egyesítjük: és szárazra pároljuk be. Ugyanilyen rendszerben újabb megosztásnak vetjük alá a maradékot 280 fokozatban; a 125—154. megosztási elemek egyesített tartalmának bepárlása útján 38 mg tiszta terméket kapunk (gami ma max = 140; kappa = 1,0). Ez a termék aluminiumoxid-lemezeken történő vékonyrétegű! kromatografálás során az alábbi R/-értéket mutatja: R/ (100) = 0,5. , 7. példa: a) BOC-Tyr-Gly-OCH3 [10,12 g BOC-tirozint 45 ml etilacetátban forrón oldunk, majd 20° hőmérsékletre való lehűlés után 3,84 g glicin-metilészter 10 ml etilacetáttal készített oldatát adjuk, hozzá. Ezután 10,4 g szilárd diciklohexil-karbodiimidet adunk az elegyhez és 25° hőmérsékleten 18 óra hoszrszat keverjük. Az elegyet azután 0° hőmérsékletre hűtjük le, 30 percig állni hagyjuk, majd a levált diciklohexilkarbamidot kiszűrjük és: a szüredéket betöményítjük. Petrolészter hozzáadása útján lecsapjuk a nyers dipeptidszármazékot, amorf viszkózus tömeg alakjában. Az elkülönített terméket etilacetát és petroléter elegyből történő újbóli lecsapással tisztítjuk, majd ugyanebből az oldószerelegyből kristályosítjuk; az így kapott termék 124—!l25°-on olvad. Szilikagélen történő vékonyrétegű kromatografálással az alábbi R/-értékeket kapjuk: 102 mg BOC-D-Ser-Tyr^Ser-Met^Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-TryJGly-OH ,(vö. 1. példa) 1,2 ml 45 90%-os piridinnel készített oldatához 50° hőmérsékleten előbb 0,035 ml n-sósavoldatot, majd 150 mgH-Lys(BOC)-Pro^Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-Asp(OtBu)-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)- 50 -Glu(NH2)-f Leu-Ala-Glu<OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu-lV2 H2 S0 4 (vö. R. Schwyzer és P. Sieber, Nature 199, 172, 1963) 1,2 ml 90%-os piridinnel készített oldatát adjuk hozzá. Keverés közben, 50° hőmérsékleten 30 55 perc múlva, majd IV2 óra múlva és végül 6 óra múlva 0,15—0,15 ml 10%-os piridines diciklohexil-karbodiimid oldatot adunk az elegyhez. Ezután 25 óra hosszat tovább keverjük, majd • 100' ml peroxidmentes éter hozzáadása 60 útján lecsapjuk! a terméket. A "kapott nyers terméket kloroform-széntetraklorid-metanol-0,1--m-ammóniumaeetát ,(pH 6,5) 8:8:17:7 arányú elegyében Criaig szerinti megosztásnak vetjük alá 140 fokozatban. A vékonyrétegű kromatog- 55 b) H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-PheMArg-15 -Try-Gly^Lys-Pro-'V.al-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro^Val-;Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Gly-jAla-Glu^Asp-Glui(iNiH2 )-Leu^Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OH (D-Ser MDéta.' ~3 9 -kortikotropin) 20 30 mg védett D-Ser1 -béta 1_39 -kortikotropinszármazékot 3 ml 95%-os trifluorecetsavban oldunk és az oldatot 1 óra hosszat hagyjuk állni 24° hőmérsékleten. Ezután szárazra párol-25 juk be az oldatot, majd! a maradékot egy acetát-alakban levő gyengén bázisos ioncserélőgyantával (Merck Nr. II) töltött oszlopon mentesítjük a trifluoreoetsav-ioíioktól. Az eluátumot liofilizálva színtelen por alakjában kapjuk 20 a szabad D-Ser1-béta 1_39 -kortikotropint. Ez a termék szilikagélen történő vékonyrétegű kromatografálás valamint papírelektroforézises vizsgálat során ugyanolyan viselkedést mutat, mint a szintetikus béta1 ~ 39 -kortikotro-35 pin. R/ (101) = 0,4. A papírelektroforézis (pH = 6,3, 5 V/cm, 24. óra) során a migrációs távolság 7 cm. A D-Ser1 -Jbéta 1_39 -kortikotropin kortikotrop hatása, a Sayers-vizsgálat során a természetes 40 hormonéhoz képest időben tartósabb és számottevően nagyobb. 14
