153664. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ACTH-hatású peptidek előállítására
25 153664 26 ges. Ezután 40° hőmérsékletre hűtjük, 500 mg diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá és nitrogén-légkörben, 40°-on 18 óra hosszat, majd 0° hőmérsékletre lehűtve további 20 óra hosszat keverjük. A levált diciklohexilkarbamidot leszűrjük, a szüredéket szárazra pároljuk be, a maradékot a diciklohexilkarbodiimid feleslegének eltávolítása céljából petroléterrel eldörzsölve többször mossuk, majd a petroléterben oldhatatlan port további tisztitás oéljából etilacetáttal eldörzsölye és dekantálva mossuk. Az így kapott nyers termék nem, mutat éles olvadáspontot, kb. 160° és 195° között olvad. Ezt a terméket további tisztítás nélkül dolgozzuk fel á következő reakciólépésben. m) H-D-Ser-Tyr-,Ser-Met-Glu-His-PíheMArg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Orn-Orn-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro^-OH-hexaacetát 100 mg fenti módon kapott nyers védett tetrakozapeptid-szármtazékot 5 ml 5% víztartalmú trifluorecetsavban oldunk és az oldatot 1 óra 'hosszat hagyjuk állni 25° hőmérsékleten. Ezután vákuumban szárazra pároljuk be1 és a maradékot azonnal többször mossuk száraz, peroxidmentes éterrel eldörzsölve és dekantálva. Az így kapott poralakú termékhez 10 ml n-ecetsavoldatot adunk, amikoris némi diciklohexilkarbamid marad oldhatatlanul. Az oldatot leszűrjük és a szüredéket a trifluoracetát- és p-toluolszulfonát-ionok eltávolítása céljából egy acetát-alakú gyengén bázisos ioncserélőn (Merck Nr. II) folyatjuk keresztül. 10 ml n-ecetsavoldattal utánamossuk és az egyesített eluátumokat liofilizáljuk. Papírelefctroforézises vizsgálat (pH = 6,2; 1000 V., 2 óra) során a líofilizátum még nem bizonyul egységes anyagnak; a szabad D^Ser1,Orn 17 ,Orn 18 -béta 1 ~ 24 -kortikotropinnak megfelelő folt (migrálás 14 cm) mellett még két további, gyengébb folt (migrálás 2,6 és 18 cm) is látható. Ezt a nyers terméket tisztítás céljából karboximetilcellulózzal (a Serva heidelbergi cég gyártmánya) töltött 0,9. cm átmérőjű, 14 cm magas oszlopon kromatografáljuk. Oldószerként, amelyben az oszlop, előállítása során a karboximetilcellulózt is szuszpendáltuk, 0,05 ml ammóniumaeetát oldatot (pH == 5,2) alkalmazunk. A fenti liofilizátumot 2 ml ilyen pufferoldatban oldjuk és az oszlopra csurgatjuk. Ez^ után egy 50 ml 0,05. mólos ammóniumacetátoldatból (pH = 5,2) és 50 ml 1,0 mólos ammóniumaoetátoldatból pH = 5,2) készített lineáris puffer-grádiens rendszerrel eluálunk. Az eluálást egy regisztráló ibolyántúli abszorbciós műszerrel ellenőrizzük. A főfrakciókat egyesítjük, az ammóniumaeetát eltávolítása céljából lioifolizáljuk és a száraz maradékot 0,01 mm Hg-oszlop nyomát alatt 40° hőmérsékleten megszárítjuk. Az így kapott .D-SerÍHOrn^Orn^-béta1-24 -kortikotropin rendkívül erős és hosszú ideig ható kortikotrop aktivitást mutat. 5. példa: a) H-Lysi(BOC)-Pro-Val-Gly-Lysl(BOC)-Lys(BOC)-NH2 5,0 g Z-.Lysi(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lysi(B;OC)-OCH3-ot, amelyet pl. a 2209/63 svájci szabadalmi leírásiban ismertetett módon 10 állíthatunk elő, 30 ml metanolban melegítés közben oldunk és az oldathoz; 400 ml 6 n metanolos ammóniaoldatot adunk. A reakcióelegyet 3 napig hagyjuk szobahőmérsékleten állni, majd bepároljuk és a maradékot terc.butanol 15 és víz elegyéből átkrisíályosítjuk. Ilymódon 4,8 g hexapeptida:midot .(pp. il97—108°) kapunk; [«]22D --48 ± lö (c = 1,05 metanolban). 2,04 g fenti módon kapott hexapeptidszarmazékot 60 ml metanolban, 200 mg palládiumos 20 '(10%) aktívszén katalizátor jelenlétében hidrogénezünk. A hidrogénfelvétel 10 óra alatt befejeződik. Katalizátort kiszűrjük és a szüredéket bepároljuk; ilymódon színtelen gyantaszerű termék alakjában kapjuk a fenti ami dot, 25 amely a szilikagélen történő vékonyrétegű kromatograf álás során egységes anyagnak és a hidrogénezetlen kiindulóanyagtól mentesnek bizonyul; R/ (110) = 0,15. 30 b) BOe-D-Ser-Tyr-Set-Met-Glu(0'tBu)^His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lysi(BOC)-Lys(BOC)-JSrH2 c5 150 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glui(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH (vö. 1. példa) és 200 mg fenti módon előállított hexapeptidamid elegyéhez 4 ml piridint és 12 mg piridm-hidro-40 kloridot adunk és az elegyet 2 óra hosszat keverjük nitrogén-légkörben, 24° hőmérsékleten. Ezután 120 mg diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá és további 24 óra hosszat keverjük nitrogén légkörben, 24° hőmérsékleten. A 45 képződött finom kocsonyás csapadékot centrifúgálással tömörítjük, felette levő piridinoldatot dekántáljuk és bepároljuk. A bepárlási maradékot éterrel eldörzsöljük, az éterben nem oldódó poralakú terméket megszárítjuk, majd 50 a hexapeptidamid eltávolítása céljából híg ecetsavval eldörzsölve mossuk. 135 g nyers védett hexadekapeptid-származékot kapunk ecetsavban nem oldódó poralakú termékként. 55 További tisztítás céljából ezt a terméket 10 ml vizes metanolban szuszpendáljuk keverés közben, amikoris egy nyomokban jelenlevő melléktermék (a dekapeptidből és diciklohexilkarbamidból képződött acilkarbamid) marad 60 oldatlanul, ezt kiszűrjük. A . metanolos vizes szüredéket szárazra, pároljuk: be és a bepárlási maradékot dimetüformamiddal felvesszük. A fentebb említett acilkarbamid további mennyisége marad itt oldatlanul; kiszűrés útján ezt is 65 eltávolítjuk. A dimetilformamidos szünedék be-13
