153497. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a Theileria nemhez tartozó protozoák szaporítására
153497 vételére1 , Theileria annulata esetében a vér szétkent állapotban való 'mikroszkópiai vizsgálata útján kimutatható Theileria annulata agamontoík alapján ismerhetjük fel, imíg Theileria parva esetében renddszerint a láz-reakció másodiktól negyedik napjáig terjedő idő .(klb. a kullancsokkal való fertőzés után 15—17 nappal) a legalkalmasabb időpont erre a célra. A tenyésztés céljaira szolgáló gazdasejt-kultúra vételének: legjobb módszere az, hogy az állatból vett sejtekből szuszpenziót készítünk, ezt centrifugáljuk, a fertőzött sejtekben gazdag réteget különválasztjuk és újból szuszpendáljuk a kultúra^közegben. A kultúra-közeg az állati sejtek szaporítására általaiban alkalmazott szokásos tápanyagokat tartalmazhatja. Célszerűen ökör-szérum, triptózfaszfátlé és Eagle-féle alaptápközeg (vö. Eagle H., Science 1955, 122, 504) keverékét alkalmazzuk, előnyösen az aminosavtartalom és vitamintartalom megnövelésével. A protozoákkal nem fertőzhető sejtszövet-kultúra előállítása céljából a fiatal hörcsögök veséjéből vett „BHK 21" sejtkultúrát tripszin hozzáadásával újra szuszpendáljuk a kultúra-közegben és azután hozzáadjuk a protozoáikat is tartalmazó gazdasejt-kultúrához. Kezdetben a közel ml-enként 3—9-10" gazdasejtet és 0,7— 3,0-10,55 BHK 21 sejtet tartalmazhat. Az így kapott vegyes kultúrát célszerűen az egyréteges módszerrel olthatjuk tovább, alkalmazhatunk azonban más átviteli módszereket is, ha biztosítjuk a kultúra szaporodásának megfelelő fizikai és kémiai feltételeket. A,protozoák szaporodását oly módon biztosíthatjuk, hogy a vegyes kultúrát 37 C° és 40 C° közötti hőmérsékleten inkubáltatjük, majd sorozatosan újabb kultúra-közegekbe visszük át a szaporított vegyes sejtkultúrát. Ezeket az átviteleket célszerűen minden harmadik vagy negyedik napon végezzük. A találmány szerinti eljárás körülményei között a sejtpopuláció a benne levő protozoákkal együtt Ikb. 24—48 órán ként kétszereződik meg. A pusztulás és keze^lési vesztésiégek beszámításával a tenyésztés harmadik vagy negyedik napjáig az eredeti populáció kb. megnégyszereződik. Az inkubáció első vagy második napján a szupernatáns szuszpenzió fcb. felét vagy harmadát dekantálhatjuk és friss tápközeggel pótolhatjuk, a jelenlevő elroncsolódott sejtek eltávolítása céljából. A deikantált szupernatáns folyadék egyes esetekben jelentős mennyiségben tartalmazhat fertőzött gazdasejteket is; ilyen esettekben ezeket összegyűjtjük és — külön a Theleria parva 'esetében — külön tenyésztésre használhatjuk fel. Amikor az edény falain már egy egysejtes réteg képződött, ezt mechanikai úton, vagy pedig kémiai kezeléssel, pl. etiléndiamin-N,,N,N',N'-tetraecetsawal (EDTA) és tripszinnel, szedhetjük le onnan. A kezdeti inkubációs szakasz után a fertőzetlen gazdasejték fokozatosan eltűnnek és a kultúra rendszerint 'magától beáll kb. 30—50% BHK 21 sejtből és 50—70% bovinsejtből (ez utóbbiak csaknem mind fertőzöttek) álló összetételre. A Theileria agamont-részecskék száma a gazdasejtekiben sejteriként rendszerint kb. 2 és 20 között, átlagosan klb. 15 körül van. A 'vegyes sejtkultúra további kultúrákra való 5 eloltását mindaddig folytathatjuk, míg elegendő mennyiségű protozoa nem áll rendelkezésre. A találmány szerinti eljárással kapott protozoák megtarthatják antigén-tulajdonságukat és attól függően, hogy hányszor lettek újabb kultúrák-10 iba sorozatosan átoltva, részleges vagy teljes elgyengülést szenvedhetnek, antigén-jellegük pedig egyes esetekben átalakulhat. így pl. a T. annulata vegyes sejtku'ltúrájá önmagában, vagy az ebből nyert protozoák felhasználhatok az ál-15 latok immunizálására a T. annulata által bekövetkező ezutáni fertőzéssel szemben. A T. parva tenyésztett szövetnkultúrája viszont immunitást nyújt a T. parva szövet-kultúrájával vagy a T. annulata szövet-kultúrájával történő 20 fertőzés ellen. A találmány lényege tehát oly eljárás a Theileria fajú 'protozoák tenyésztésére, amelynek értelmében az említett protozoa spóráit tartalmazó gazdasejteket tenyésztünk egy e pro'tozaá-25 val nem fertőzhető sejtszövet-kultúra, pl. az újszülött hörcsögök veseszövetéből tenyésztett BHK 21 sejtszövet-kultúra egyidejű tenyésztése mellett, tápanyagokat tartalmazó vizes közegben tenyésztett vegyes kultúra alakjában. £0 A találmány további tárgya a Theileria fajú élő protozoákat .tartalmazó antigén^amyag előállítása, a protozoákkal nem fertőzhető sejtszövet-kultúrával együtt tenyésztett gazdasejt-kultúrában, vizes tápközegben tenyészttett ve^c5 gyes kultúra alakjában. Ez ismert műveletekkel, pl. a 3. példában leírt módon történhet. Végül a találmány tárgyát képezi a fentebb leírt antigén-anyagot tartalmazó vaccina elő-40 állítása, az, immunreakeió kiváltására 'megfelelő adagolásban kiszerelt alakban is, A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik. 45 1. példa: Gazdasejt-kultúra előállítása. 50 Egy fertőzés iránt érzékeny, jóminőségű 'keletafrikai fajtájú borjúból, amelyet T. annulata (Tova törzs) schizontáit tartalmazó vérrel való beoltás útján fertőztünk, a .betegség aktív szakaszában vért vettünk vénanpunlkció útján. A 100 55 ml vér-mintához 10 iml 1000 meg/ml töménységű heparin oldatot adtunk <és az elegyet 5 percig centrifugáltuk 1400 g-nek megfelelő fordulatszámmal. A ibőrszerű bevonatréteget elkülönítettük és egy 5 ml-es centrifuga-csőbe 60 vittük, majd 5 percig centrifugáltuk 900 g-nek megfelelő fordulatszámmial. A bevonatréteget megint elkülönítettük és 20 'ml tápközegben szuszpendáltuk. Itt és a' következő példákban leírt eljárások 65 során oíy tápközeget alkalmaztunk, amely 10 tf. 2
