153497. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a Theileria nemhez tartozó protozoák szaporítására

I 5' nesz bovin-széruimból, 10 tf. rész 2%-os triptóz-foszfát léből és 80 tf, rész Eágle-féle alaptápközegből állt, ez utóbbi olyan módosításával, hogy az a normális aminosav- és vitaminkonoentráció 2,6-szorosát tartalmazta. 5 A fenti módon kapott bavin-szövetsejt szuszpenzióhoz egyenlő térfogatú tripszinezett BHK 21 sejtszuszpenziót adtunk (előállítva az alábbi előírás szerint) és az így kapott vegyes' kultúrát alkalmaztak azután további átoltásokra és sza- 10 paritásra. ' A BHK sejtszuszpenzió előállítása. Egy lapos palackban tenyésztett BHK 21 sejt- 15 kultúra-szuszpenzió szupernatáns folyadékát egy centrifugaKSŐbe dekantáltuk. Egy 37 C° hőmérsékletre előzetesen 'felmelegített sóoldatot (10 ml, 120 ml-es palackban),, amely 0,02% etiléndiamin-N,N,N',N'-tetraecetsav-nátriumsőt 20 és 0,02% tripszint is tartalmazott és kalciumtól és magnéziumtól mentes ortofoszfát-sóval volt pufferezve, adtunk ezután a palack falain .megmaradt egysejt-réteghez. A palackot 37 C° hőmérsékleten 4 percig inkubáltatjuk, majd amint 25 az említett egy sejt-réteg teljesen levált, hozzáadtuk a szupernatáns szuszpenzióhoz és 5 percig centrifugáltuk 224 g-nek megfelelő fordulatszámmal. A szupernatáns folyadékot dekantáltuk és kiselejteztük, a megmaradt sejteket pedig £0 újból szuszpendáltuk a tápközeg oly mennyiségében, hogy milliliterenként kb. 2—4X105 BHK 2,1 sejtnek megfelelő koncentrációt kapjunk. Átoltások és szaporítás. Az 5X106 bovinsejt/ml és 1,5X105 BHK 21 sejt/ml koncentrációjú elegy-szuszipenziót 10 mles részeikre osztottuk és ezek 'mindegyikét egyegy 120 ml-es lapos palackba vittük. A palac- 40 kokat fekvő helyzetben egy inkubátorba helyeztük és 37—38 C" hőmérsékleten tartottuk. Hogy a roncsolt sejtek egy részét eltávolítsuk, a szupernatáns szuszpenzió egyharmad részét 24 óra múlva, majd 48 óra múlva dekantál- 45 túk a palackokból és mindenkor friss tápközeggel pótoltuk. 5 nap múlva a szupernatáns szuszpenziót egy centrifuga-csőbe dekantáltuk és a palackok faláról a »megmaradt egysejt-réteget etiléndiamintetraeoetsavvál és tripszinnel 50 való kezelés útján, a BHK sejtszuszpenzió készítési előírásában leírt módon eltávolítottuk a palack faláról. A két frakciót egyesítettük: és 5 percig centrifugáztufc 225 g-nek megfelelő fordulatszámmal. A sziupernatáns folyadékot dekantáltuk és .kiselejteztük, az egyes palackok- 55 bél kapott sejteket pedig 40 ml friss tápközegben újra szuszpendáltuk és négy 120 ml-es palackba osztottuk el őket. A fenti eljárást több ízben megismételtük, ßo 2. példa: Egy fertőzésre érzékeny, jóminőségű keletafrikai fajtájú bikát Theileria parva mikro- g5 6 organizmussal fertőztünk és a hőmérséklet emelkedés utáni harmadik napon egy 1 cm3

nagyságú lympna nodus darabolt vettünk ki, Ezt ollóval felaprítottuk és 8 iml tápfcözegben, amely 300 meg/ml heparint is tartalmazott, diszpergáltuk. A szuszpenidált sejték és szövet-tönmelékek elegyét a tápközeggel együtt egy durva, 550 millimikron lyukbőségű szitán átszűrtük, majd 5 percig centrifugáltuk 224 g-nek megfelelő fordulatszámmal. A szupernatáns folyadékot dekantáltuk és kiselejteztük, a sejteket pedig 10 ml tápközegben újra szuszpendáltuk. Az így kapott szuszpenziőhoz egyenlő térfogatú tripszinezett BHK 21 sejtszuszpenziót adtunk, amelyet az 1. példában Mrt módon készítettünk el, majd az így kapott vegyes kultúrát sikeresen átoltottuk és szaporítottuk az 1. példában leírt módszerrel; ennek során az 1. példa szerintivel megegyező eredményt kaptunk.. 3. példa: Az 1. példában leírthoz hasonló anódon átoltott vegyes sejtkultúrát oentrifugáltuk és újra szuszpendáltuk, Szarvasmarhákat beoltottunk ezzel a szuszpenzióval; eredményként határozott nodus- és lázr-reakciót értünk el. A szarvasmarhákat azután, későbbi időpontban T. annulata mikroorganizmussal fertőzött vérrel oltottuk be, immunitásuk ellenőrzése céljából. Semilyen reakció nem: volt megfigyelhető a. kezelt állatokon, mind az előzetes immunizáló kezelésben nem részesített állatok heveny reakciót mutattak és. ezek fele elhullott. 4. példa: A 2. példában leírthoz hasonló módon kapott és átoltott vegyes szövetkultúrát, centrifugáltuk és ú'jra szuszpendáltuk. Szarvasmarhákat be-. oltottunk ezzel a szuszpenzióval és eredményként határozott reakciót figyelhettünk meg. Az állatokat később T. annulata mikroorganizmussal fertőzött szövetkultúrával oltottuk be; semilyen reakció nem volt tapasztalható. 5. példa: A 2. példában leírthoz hasonló módon kapott és átoltott vegyes szövetkultúrát centrifugáltuk és újra szuszpendáltuk. Szarvasmarhákat beoltottunk ezzel a szuszpenzióval; eredményként határozott, reakció volt megfigyelhető. Az állatokat később T. parva mikroorganizmussal fertőzött szövetkultúrával oltottuk be; semilyen reakció nem mutatkozott. Szabadalmi igénypontok: 1, Eljárás a Theileria nemhez tartozó protozoák szaporítására és adott esetben ilyen pro-3