152836. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hirudin tisztítására

1528: 3 hérje-szennyezésekétől ós színező anyagokétól. Ezek a felismerések nem voltak előre láthatók, mert az ipari technológiával előállított nyers hirudin magától értetődően több szenynyező anyagot tartalmaz, mint az orvosi piócák 5 izolált feji részéből kinyert hirudin, és így az volt várható, hogy az orvosi piócák feji részéből előállított nyers hirudin tisztítására vonatkozó ismert, számos lépés kombinációjából álló eljárások a sziennyezettebb hirudin tisztítására 10 \ csak további kiegészítéssel, tehát még több lé^ péssel alkalmazhatók. Felismeréseink váratlanok voltak azért is, mert .a hirudin tisztítására eddig használt két cellulózszármazék közül a savanyú jellegű, kationcserélő tulajidonsággal ren- 13 delkező oxicellulóz a hirudint megköti, szenynyezéseit azonban nem; ezzel szemben a karbo'ximetilcellulóz éppen a szennyezéseket tartja , vissza, a hirudint pedig nem. Másrészről a piócák izolált feji részéből előállított nyers hiru- ,10 dint diatilaminoetilcellulózon lúgos közegben kromatografálták, ezzel szemben az Ecteola-cellulózon savanyú közegben végzett adszorpciós elkülönítés hatásfoka megközelítően nagyságrenddel jobb. - 25 A találmány eljárás nyers hirudin tiszítására, amely abban áll, hogy az orvosi piacából előállított nyers hirudin "tömény vizes oldatából a) karboximetiloellulózon 3,30—4,30 pH-határok között, célszerűen a hirudin izoelektromos 30 pontján az alvadásgátló hatással nem rendelkező fehérjéket a hirudintól elkülönítjük, majd az adszorbenstől elkülönített oldatból a hirudint ismert módon izoláljuk; vagy b) Ecteola-cellulózon a hirudint megkötjük 35 savanyú közegben, előnyösen pH 5,0—5,50 határok között, az alvadásgátló hatással nem rendelkező, kísérő fehérjéket és színező anyagokat az adszorbensről kimossuk, majd a hirudint elektrolit oldattal leoldjuk az adszorbensről és .40 az eluatumfoól ismert módon izoláljuk. A találmány szerinti eljárás értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy az ipari technológiával előállított nyers hirudinból NaCl-ra néz- i5 ve 0,01—0,05 mólos, 3,30—4,30 pH-jú, 0,01—0,05 mólos pufferoldat segítségével 4—10%-os vizes oldatot készítünk, s ezt megfelelő méretezésű karboximetilcellulóz oszlopon folyatjuk át 10— 60 ml/óra átfolyási sebességgel. A fenti hirudin- 50 oldat átfolyatását és eluálását lépcsőzetesen 0,50 mól/liter NaCl koncentrációig növekvő pufféroldattal végezzük, ami az alvadásgátló tulajdonságokkal nem rendelkező fehérje-komponenseknek és színezékeknek a hirudintól való elkülö- 55 nítését fokozott mértékben előmozdítja. Az osz^lopról lefolyó oldatot tetszés szerint 2—10 ml-es frakciókban fogjuk fel, s a frakcióknak meghatározzuk mind az optikai sűrűségét 280 mu hullámhosszon, mind pedig antäthrombin aktivitá- 60 sát. Az antithrombin-aktivitást mutató csövet tartalmát ezután egyesítjük, s az egyesített oldat vákuumban, 20—40 C° hőmérsékleten végzett besűrítése (az eredeti térfogat 1/2—1/4-ére) után belőle a hirudint ismert módon, szobahő- 65 !6 4 mérsékleten szerves oldószerrel, célszerűén etilalkohollal vagy acetonnal kicsapjuk. Ügy is eljárhatunk, hogy. a nyers hirudin 4—. 10%-os, NaCl-ra nézve 0,01—0,05 mólos, 5,0— 5,50 pH-jú 0,01—0,05 mólos pufferes "oldatát Ecteola-cellulózon engedjük át. Ilyenkor a hirudin az adszorbens oszlopon megkötődik s arról, 0,50 mól/liter koncentrációig lépcsőzetesen növekvő konyhasótartalmú pufferoldattal oldjuk le. Az adszorbens-oszlopról kifolyó oldatot tetszés szerint 2—10 ml-es frakciókban gyűjtjük, s a frakciók optikai sűrűségének spektrofotometriás úton, az antitbrombin aktivitásnak pedig titrálás útján történő meghatározása után a- hirudin-tartalmú frakciókat egyesítjük. Az egyesített és besűrített oldatból a hirudint ismert módon, szerves oldószeres kicsapással elkülönítjük és kinyerjük.' A két módszer egyesíthető is, így a karboximetiloellulózon kromatografált hirudin tovább tisztítható Ecteolacellulózon, az Ecteolacellulózon tisztított hirudin pedig karboximetilcelluló^zon. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei az ismert eljárásokkal szemben: alkalmazásának nem előfeltétele a piócák feji részéből kinyert magas hatóértékű nyerstermék, mint kiindulási anyag, továbbá rendkívül egyszerű, könnyen kivitelezhető és gazdaságos. Eljárásunk kivitelezését az alábbi példák Szemléltetik: 1. példa. 500 mg 200 ATE/mg (Anti-Thrombin-Egység) hatóértékű nyers hirudint ^(összesen 100 000 ATE) 10 ml 0,02 M NaCl-ot tartalmazó 5000 pH-jú 0,02 mólos ecetsav-nátriumacetát pufferben oldunk és az így kapott oldatot a következőképpen elkészített adszorbens-oszlopra viszszük: 8 g szokásos eljárással aktivált Whatmann-féle Ecteola-cellulózport szobahőmérsékleten 1 órán át végzett kevertetéssel 40x-es térfogatú, 0,02 M NaCl-ot tartalmazó 5.00 pH-jú, 0,02 mólos ecetsav-Tiátriűmacetát pufferrel kiegyensúlyozunk, majd belőle — a finomszemcséjű, nehezen ülepedő részecskék dékantálással való elkülönítése után — 20 mim 0-jű, 80 mm magas oszlopot készítünk. A tömény hirudinoldatot az oszlop tetejére rétegezzük. A kromatografálást a fentemlített pufferrel, lépcsőzetesen növekvő konyhasó-koncentráció jelenlétében a következő oldószermennyiségek felhasználásával végezzük: 50 ml 0,02 M, 60 ml 0,05 M, 60 ml 0,1 M és 60 mi 0,20 M NaCl-ot tartalmazó pufferoldat. 30 ml/óra átfolyási sebesség mellett összesen 30x10 ml frakciót gyűjtünk. A frakciók optikai sűrűségét spektrofotometriásán 280 mu hullámhosszon, alvadásgátló hatásukat pedig tiszta fibrinogénen történő titrálással határozzuk meg. A mérési adatokat a csatolt ábra tünteti fel, ahol az abcisszám a gyűjtött frakciók sorszáma, az ordinátán pedig az optikai sűrűség 280 mu hullámhosszon mért értékei vannak feltüntetve.