152836. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hirudin tisztítására

5 152836 6 A folytonos vonallal húzott görbe a fehér jetártalom változását, az eredményvonallal rajzolt pedig a hirudimtartalom változását ábrázolja. Az; ábrából világosan kitűnik, hogy míg a kísérő szennyezések nagy" tömegben alacsony NaClkoncentrációjú pufferrel folynak le az adszorbensről, addig a hirudin 0,20 M NaÓl-dal eluálható az oszlopról. Az 5 .(19—23. sz. csövek) hirudintartalmú frakció egyesítése után az oldat térfogatát vákuumban .40 C° hőmérsékleten felére csökkentjük, majd az oldatot 0 C° hőmérsékletre hűtjük, s 4 térfogat ugyanilyen hőmérsékletű abszolút etanolt adunk hozzá. A kicsapódott hirudint centrifugálással való elkülönítés után abszolút etanollal szárítjuk. A végtermék súlya 60 mg, aktivitása 1200 ATE/mg öszszesen 72 000 ATE. A hozam: 72%-os, 2. példa. 500 mg 340 ATE/mg hatóértékű nyers hirudint (összesen 170 0O0 ATE) 7 m% NaCl-ra nezve 0,05 mólos, 5,10 pH-jú 0,02 mólos ecetsavnátriumacetát pufferben oldunk s az így elkészített oldatot aktivált, majd ugyanilyen pH-jú és konyhasó=tartalmú pufferrel kiegyensúlyozott 20 mm 0-jű éts 200 mm magas Whatman-féle Ecteoia-cellulóz oszlop tetejére rétegezzük. A kromatografálást a fenti pufferrel lépcsőzetesen növekvő NaCPkoncentráció jelenlétében változatlan hidrogénionkoncentráció mellett végezzük az alábbi oldószermennyiségek felhasználásával: 150 iml 0,05 M, 200 ml 0,10 M, 150 ml 0,20 M, 200 ml 0,30 M és 150 ml 0,50 mólos NaCl-ot tartalmazó pufferoldat; átfolyási sebesség 60 ml/óra, a gyűjtött frakciók száma 90x10 ml. A spektrofotometriásán 280 mu hullámhosszon mért/optikai sűrűség és a titrálás útján meghatározott antithrambh-Maiktivitás alapján a hirudin 0,30 M NaCl hatására eluálódik az adszorbensoszlopról — szemben a kísérő fehérjeszennyezésekkel, amelyek 0,05, 0,10, 0,20 és 0,50 M NaCl 'koncentrációnál különülnek el. A hirudintartalmú frakciók egyesítése után az oldat térfogatát vákuumban 1/3-ára csökkentjük, majd 0 C°-ra hűtjük s ezen a hőmérsékleten 4 térfogat —5 C° hőmérsékletű abszolút etanollal belőle a hirudint kicsapjuk. A csapadékot cent^ rifugálással ülepítjük, abszolút etanollal mossuk, Végül szárítjuk. A végtermék súlya 84 mg, hatóértéke 1600 ATE/mg, összesen 134 000 ATE. A kitermelés a kiindulási értékre számítva 78%-os. 3. példa. < . 350 mg 350 ATE/mg hatóértékű nyers hirudint (összesen 140 000 ATE) 7 ml 0,05 M NaCl-ot A kiadásért felel: a tartalmazó 3,80 pH-jú, 0,05 M kocentrációjú ecetsav-nátriumiacetát puff erben oldunk s az így nyert oldatot a szokásos módon aktivált, majd a fentivel megegyező pH-jú és konyhasótartal-5 mú pufferrel kiegyensúlyozott 20 mm 0-jű és 300 mm magas Whatman^féle karboximetilcellulóz oszlop tetejére rétegezzük. A kromatográfiai lépcsőzetesen növekvő NaCInkoncentrációval változatlan hidrogénionkoncentráció mellett 150 10 ml 0,05 M, 150 ml 0,10 M és 10 ml 0,2 M NaCl tartalmú puffferoldattal végezzük; 60 ml óránkénti átfolyási sebességgel 40x10 ml frakciót gyűjtünk. Az 1. és 2. példában megadott kiértékelés 15 alapján a hirudintartalmú frakciókat (ezek a leggyorsabban futnak le az adszorbens oszlopról 0,05 M NaCl koncentrációjú puffer jelenlétében) egyesítjük, majd az 50 ml térfogatot vákuumban 20 ml-re sűrítjük be. 10 C°-ra való 20 hűtés után az oldathoz —10 C°-ra hűtött 5x-ös térfogatú abszolút etanolt adunk s a kicsapódott hirudint centrifugálással elkülönítjük. Abszolút etanollal való mosás után abszolút acetonnal szárítjuk meg a végterméket. A végter-25 mék súlya: 142 mg, aktivitása 900 ATE/mg, öszszesen 127 800 ATE. A kiindulási anyagra számított hozam: 90%. 30 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás nyers hirudin tisztítására cellulózalapú adszorbensekkel, melyre jellemző, hogy az orvosi piócából előállított nyers hirudin tö-35 meny vizes oldatából, a) karboximetilcelhilózon 3,30—4,30 pH határok között, célszerűen a hirudin izoelektromos pontján az alvadásgátló hatással nem ren-40 delkező fehérjéket és színező anyagokat a hirudintól elkülönítjük, majd az adszorbenstől elkülönített oldatból a hirudint ismert módon izoláljuk, vagy 45 / b) Ecteola-cellulózon a hirudint savanyú közegben, előnyösen pH 5,0—5,50 határok között megkötjük, az alvadásgátló hatással nem rendelkező kísérő fehérjéket és színező anyagokat az adszorbensről kimossuk, majd a hirudint 50 elektrolit oldattal leoldjuk az adszorbensről és az eluátumból ismert módon izoláljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, melyre jellemző, hogy a hirudinnak a kísérő fehérje-szennyezésektől és színező anya-55 goktól való elkülönítésére és visszanyerésére 0,01—0,50 M NaCl tartalmú szervetlen vagy szerves puffereket, előnyösen 0,1—0,05 mólos ecetsav-nátriumacetát puffert alkalmazunk. igi és Jogi Könyvkiadó igazgatója. i 6607335. Zrínyi (T) Nyomda, Budapest V., Balassi Bálint utca 21—23. 3