152771. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 4-aminometil-ciklohexán-karbonsav antifibrinolitikus hatású izomérjének előállítására
152771 A 4,5 pH-értékre történő tompítást az alábbi összetételű pufferrel végeztük: ecetsav 40 ml piridin 40 ml aceton 150 ml desztillált vízzel hígítva 1000 mi-re A ninhidrin-reagenst a.Heilman J., Barollier J. és Watzke E. által leírt (Hoppe-Seyl Zeit- 10 schrift, 309, 219, 1957) összetételiben alkalmaztuk, a következő módon előállítva: 0,050 g kalciumaoetátot 5,0 ml desztillált víz és 1,0 ml ecetsav elegyében oldottunk, az oldathoz 50 ml acetont adtunk és az elegyet a csapadék teljes ol- 15 dódásáig ráztuk. Az így kapott elegyben 0,50 g ninhidrint oldottunk. Az így elkészített reagens csupán 1 napig használható fel. A kromatogrammon kapott színes folt oldására frissen desztillált vagy analitikai minőségű 20 metanolt alkalmaztunk. Összehasonlító vizsgálatok céljaira oly törzsoldatókat készítettünk, amelyek a 4^aminometil-ciklohexán-ikarbonsav aktív izoméxjét tiszta állapotban tartalmazták, az alábbi koncentráció- 25 jú vizes oldatokban: 20 mg/ml, 10 mg/ml, 5mg/ ml, 2,5 mg/ml. Ezelk a mennyiségek a 4-aminometil-iciklahexán-karbonsav izomérelegyből pl. elektroforézissel elválasztott tiszta 4-aminometil-ciklóhexán-kar'bonsav-izamér 120, 60, 30, ill. 15 30 gamma mennyiségének felelnek meg. Analitikai módszer: adatok, valamint az infravörös spektroszkópiai mágneses mag-rezonanciai és röntgen-krisztal lográfiai vizsgálatok eredménylei azt mutatjál hogy a 4-aminometil-ciklolhexán-karbónsav ak tív izomérje kristályos alakban ikerionos bels sót képez; kristály tengelyei: a = 6,29, b = 7,9 és c = 16,66. Az antifibrinolitikus aktivitás mennyiséi meghatározását Christensen L. E. (J. clin. ír vest, 28, 163, 1949) és Wasseiman A. E. <é mtsai (J. Lab. clin. Med., 4, 812, 1953) módszt rének felhasználásával végeztük. E módszer szí rint a . 4-amiinametil-ciklohiexán-;karbonsav aktí izomórjének azt a mennyiségét mérjük, amel szükséges in vitro a streptdkinázzal előidéz© firbrinolizis 50%-os gátlására. A rendszer fibr nogénből, plazminogénből és trombinból ál ezekhez 6 egység sztreptokinázt adunk a litiki hatás kiváltása céljából. A vizsgált 50%-os gá lás megfelel 3 egység szitreptokináz litikus aJ 'tivitásának. A sztreptokináz elvileg a plazm nogén proenzimet plaziminná aktiválja; ez utó] bi enzim fibrinolitikus aktivitással rendelkezi' A vizsgálat során meghatározzuk azt az ide amely szükséges ahhoz, hogy' a képződött pia min egy összehasonlítási alapul szolgáló szál ványos fibrin-alvadékot feloldjon. A jelen leírásban szereplő különféle vegyül1 tek in vitro antifibrinolitikus aktivitására v natkozó adatokat, 6 egység sztreptökin 50%-os gátlása alapján megadva, az alábbi tá1 lázatban foglaltunk össze: 6 mikroliter mennyiséget vettünk a megfelelő törzsoldatökfoól és ezeket a kromatográfiai papír külön-külön felületrészeire vittük fel. Az ismeretlen vizsgálandó oldatot is felvittük a papír egy további helyére. Ezután a kromatográfiai papírt, a pufferaldat rápermeitezése útján megnedvesítettük, ráhelyeztük a készülék íhűtőlapjára és az elektrofoajézist a fentebb leírt módon lefolytattuk. A kromatográfiai papírt azután hűvös levegővel 2 óm hosszat szárítottuk, majd bemártottuk a ninhidrin-reagensbe és újból megszárítottuk. Ezután a papírt sötét helyen, légzáró tartányban tartottuk, tömény kénsav felett, hogy a légkör ammónia-mentességét biztosítsuk. 20 óra múlva a színes foltokat a környező színtelen, papír megfelelő részével együtt elkülönítettük és metanollal extraháltuk. A kapott vörös színű oldatokat fcülönr-külön leszűrtük és meghatároztuk az 500 millimikronnál mutatott extinkciójukat, az ellenőrző mintáéval összehasonlítva. A kapott értékéket vettük alapul a vizsgálandó mintában jelenlevő aktív 4-aminometil-ciklohexan-karibonsav izomer mennyiségének meghatározására. Az inaktív izomer mennyiségét ugyanilyen eljárással határoztuk meg. A 4-iaminometilHCÍkloihexán-kairbonsav aktív izomérj ének kristályos alakban mutatott tulajdonságai: A fent leírt analitikai eljárás' során kapott 35 40 45 50 55 Táblázat Vegyület A végy v let Viszony- t -nyl( lagos geg 'menrn sége aktivitás v epszilon-aimino-kapronsav 1 4 gamm 4-aminometil-ciklolhexán--karibonsav izomérelegy (10% aktív izomerrel) 2 2 ] gamn 4-iaminometil-ciklofliexán--kanbonsav aktív izomer 20 0,5 • I ! *\\ t^ÜDjgamn 4-aminometil-ciklohexánr-0,1 30 -karbonsav inaktív izomer gamn A találmány értelmében a 4-aminometil-< lohexán-ikarbonsav legalább 90%-os :menny 60 gi arányban antifibrinolitikus aktivitású : mérjét, amely kromatográfiai papíron kb. pH értekre tompított vizes közegben 50 V, feszültségesés és 0 mA/cm intenzitásesés r lett végzett nagyfeszültségű elektroforézis so 65 200 perc alatt 135 mm távolságra migrál, v
