152655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-keto-4-klór-szteroidok előállítására
152655 gazdagítja a mikrobiológiai szteroid-átalakításokkal foglalkozók fegyvertárát. A találmány eljárás 3-keto-4-klóir-szteroidak előállítására, amely abban áll, hogy az I képletű 4Tklór-progeszteronból mikrobiológiai úton, Fusarium, caucasicum segítségével a II képletű 44dlór^androszt-4-én-3,17-diont állítjuk elő, majd ebből Fusarium caucasicum vagy Alcaligenes faecalis K9-2 segítségével a III képletű új 4Hklór-androszt-l,4-dién-3,17-diont állítjuk elő, és utóbbit adott esetben Fusarium caucasicum segítségével a IV képletű új 4-klór-17<*-oxa-D4iomcHandroszta^l,4-dden-3,17b-dionná alakítjuk át. Az Alcaligenes faecalist előnyösen SA 5-g jelű tátal'ajon tenyészthetjük. E táptalaj összetétele a következő: 290 g pepton 50 g húskivonat 9 ml sörélesztő-kivonat, csapvízzel feltöltve 5 l-re; pH sterilezés előtt 6/5-7,0. A törzset burgonyás ferdeagar táptalajon tarthatjuk fenn, hetenkénti átoltásokkal. A Fusarium oaucasicumot ugyancsak burgonyás ferdeagar on tarthatjuk fenn. A tenyésztéshez előnyös az alábbi inoculum-táptalaj öszszetételt (Richárd-féle táptalaj) használni: 50 g glükóz 0,5 g KH2 P0 4 2,5 g MgS04 .7H 2 Ö 1,0 g KNO3 10,0 g NH4 N0 3 , csapvízzel 1 literre feltöltve. A tenyésztő táptalaj összetétele pl. a következő lehet: 0,05 glükóz 15,0 g pepton 6,0 gkukoricalekvár, csapvízzel 1 literre feltöltve; pH sterilezés előtt 6,5. Az organizmusokat 25 C° és 37 C° közötti hőmérsékleten, előnyösen 28 C°-on tenyészthetjük. A tenyészethez acetonban vagy alkoholban oldva adagolhatjuk az átalakítandó szteroidot. A szteroidok átalakulását pepírkromatográfiás eljárással! ellenőrizhetjük. A vizsgálat elvégzéséhez a fermentátumot megfelelő polaritású organikus oldószerrel, pl. diklóretánnal extrahálihatjuk. Az extraktumot bepároljuk, a bepáriési maradékot aceton-kloroform elegyben felvesszük úgy, hogy a koncentrátum szteroidtartalma 4 mg/l körül legyen. Ebből az oldatból 50—1O0 mdikrolitert cseppentünk fel 30% propilénglikolt tartalmazó metilalkohollal impregnált, Maoherey-Nagel 214-es papírra. A mozgó fázis széntetraklorid és metilciklohexán 1:1 arányú, propilénglikóllal telített elegye. Ebben a rendszerben a 4-klór-and(roszt-4-én-3,17-dion 0,73 R/ értékkel, a 4-klór-androszta-l,4-dién-3,17-dion 0,66 R/ értékkel, és a 4-Mór-17a-oxa-D4iomo-androszta-l,4-dien-3,Í7b -dión a felcseppentés helyén fut. A kromatogrammon a szteroid-foltokat ultraibolya kontakt fotózással, vagy antimon-penta-5 klorid kloroformos oldatával hívhatjuk elő. A fermentáció végén a fermentációs folyadékot megfelelő polarítású szerves oldószerrel, pl. széntetrakloriddal, diklóretánnal, diklórmetannal, kloroformmal, benzollal vagy etilacetáttal 10 többször kivonatoljuk, a kivonatokat egyesítés után szárítjuk, majd szárazra pároljuk. A száraz maradék néhány alkalommal közvetlenül kristályosítható, más esetekben aluminiumoxidon végzett kromatografálás után nyerhetjük 15 ki a dehidrogénezett terméket. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa. 20 4-klór-androszt-l,4-dién-3,17-dion előállítása 4-klór^androszt-4-én-3,17-dionból Fusarium caucasicum 9 napos ferdeagar tenyészetéről 5 ml steril vízzel készült szuszpenzió 1—1 ml-ével oltottunk be 3X100 ml Ric-25 hard táptalajt 500 ml-es Erlenmeyer lombikokban. A lombikokat 200-as fordulatszámú, 2 cm-es kitérésű síkrázóasztalon 28 C°-on inkubáltuk, 2 nap múlva ezekkel a tenyészetekkel 5 1 F jelű táptalajt oltottunk be üvegfermen-30 torban. A fermentort 300-as fordulatszámmal kevertettük, percenként 5 1 levegőt bocsátottunk rajta keresztül, és 28 C°-os vízfürdőben inkubáltuk. A 24 órás tenyészetet vízzel hígítottuk, és 6 liter ilyen hígított tenyészethez 1,2 35 ,g 4-klór-androszt-4-én-3,17-diont adagoltunk 50 ml acetonban oldva. A fermentáció lefutását papírkromatográfiával ellenőriztük; 24 óra eltelte után már csak kevés átalakulatlan kiindulási anyagot, sok 4-klór-androszt-l,4-dién-40 -3,17-diont és egy polárosabb foltot észleltünk, melyet a 4-klór-17a-oxa-D^homo^androszta-l,4--dien-3,17-dion adott. A micélium leszűrése után a fermentlevet háromszor 1/5 térf. széntetrakloriddal extrahál-45 tuk. Az extraktumokat egyesítettük, vízmentes nátriumszulfáttal szárítottuk, majd vákuumban szárazra pároltuk. Aluminiumoxidon benzolaceton rendszerben kromatografálva, 4-klór-androszt-4-én-3,17-dion mellett 4-klór-androsz-50 ta-l,4-dién-3,17-dion volt nyerhető. Metanolos átkristályosítás után o.p.: 177—178 C° (<*)D :173 0 (c=l, CHCI3) MEOH 55 max. : 246 m u *<* E = 4 ' 08 Ez utóbbi vegyület az irodalomban még nem szerepel. 2. példa. 60 4-klór-17aí-oxa-D-, homo-androszta-l,4-.diein-3,17b -dión előállítása 4~Hklór-androszt-4-én-3,17-dionból Az átalakítást az 1. példában leírttal azonos 65 módon, de 96 órán át végeztük. A fermentáció
