151959. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oxitocin előállítására

151959 nagy méretekben való egyszerű és gazdaságos dolgozást tesz lehetővé tevő alakban alkalmazzuk. Az azidos kapcsolási módszer ugyanis az irodalomban ismertetett alakjában igen kényes művelet, amelynek nagyobb méretekben való kivitele esetén a mellékreakciók oly mértékben előtérbe léphetnek, hogy a termék gyakorlatilag semmi aktivitást nem mutat; a találmány szerinti módon, vizes dimetilformamidos közegben lefolytatott azidos kapcsolás esetében az említett mellékreakciók annyira visszaszorulnak, hogy az azid kipreparálása nélkül is tiszta terméket kapunk igen jó termeléssel. Ugyancsak döntő jelentőségű lépése a találmány szerinti eljárásnak a védett nonapeptid forró alkoholos kezelése, amely igen egyszerű módon és kitűnő hatásfokkal biztosítja nemcsak a kisebb molekulasúlyú melléktermékek, hanem a kész Oxitocin , oldatában inhibiciós hatást kifejtő szennyezések eltávolítását is. Ezt az a tény is bizonyítja, hogy a tisztítási művelet során a termék fajlagos aktivitása nagyobb mértékben növekszik meg, mint ahogyan a súlycsökkenés alapján számítva adódnék. A találmány szerinti eljárásnak ezek az új tényezői tehát együttesen biztosítják azt a lényeges előnyt, amelyet a végtermék aktivitása, tisztasága és hozama terén elérni sikerült. A találmány szerinti eljárás — amint a fentebbi általános ismertetésből kitűnik — hat főlépésből áll: 1. A p-klórkarbobenzoxi-L-prolü-L-leucil-glicinamid előállítása; 2. a p-klórkarbobenzoxi-L-glutaminil-L-aszparaginil-S-benzil-L-ciszteinil-hidrazid előállítása; 3. a p-klórkarbobenzoxi-S-benzil-L-ciszteinil-L-tirozil-L-izoleucil-hidrazid előállítása; 4. a p-klórkarbobenzoxi-hexa- és nonapeptid szintézise; 5. a védett nonapeptid tisztítása és védőcsoportjainak eltávolítása; 6. a nonapeptid hidrogénperoxidos oxidációja oxitoeinná. A találmány szerinti eljárás egyes lépéseinek gyakorlati kivitele az alábbi módon történhet: 1. lépés: Kristályos p-klórkarbobenzoxi-L-leucint tetszőleges módon kapcsolunk glicinészterrel, a nyert védett dipeptidésztert jégecetes brómhidrogénsav oldattal való kezelésnek vetjük alá, amikoris a p-klórkarbobenzoxi-csoport lehasad. A szabad dipeptidésztert ugyancsak tetszőleges módon kapcsoljuk p-klórkarbobenzoxi-L-prolinnal és a nyert védett tripeptidésztert amiddá alakítjuk és az amidot védőcsoportjaitól megszabadítjuk. Ilyen eljárásmód esetén 12 C°-kal magasabb olvadásponttal nyerjük a vízből kristályosítható L-prolil-L-leucil-glicinamidot, mint azt R. Boissonnas és társai (loc. cit.) leírják, 2. lépés: A középső tripeptid szintézisénél és a molekula további felépítésénél nem célszerű használni a legkiterjedtebben alkalmazott kondenzáló ágenst a diciklohexilkarbodiimidet, mert utóbbival a karboxamid csoportok (glutarnin, aszparagin és glicinamid) is reakcióba lépnek nitril 5 keletkezése közben, így nem kívánatos mellékreakciók játszódnak le a peptidkötés kialakításakor. A kitűnően kristályosodó p-klórkarbobenzoxi-L-aszparagint o-fenilénklórfoszfittal, mint kondenzáló ágenssel viszonylag igen ma-10 gas termelési hányaddal lehet az S-benzil-L-ciszteinmetilészterrel kapcsolni. A védőcsoport eltávolítása után p-klórkarbobenzoxi-L-glutaminnal kapcsolva nyerjük a védett tripeptidésztert, mely szemben az irodalmi adatokkal, 15 csakúgy, mint a védett dipeptídészter vizes dioxánból kristályosítható. A védett tripeptidészter ismert módon hidraziddá történő alakítása után kapcsolható a C-terminális tripeptidamiddal. 20 3. lépés: Az N-terminális tripeptid kialakítása céljából N-p-klórkarbobenzoxi-S-benzil-L-ciszteint tetszőleges kapcsolási módszerrel (pl. DCC-vel) le-25 het L-tirozin-metilészterrel kondenzálni, de különösen nagyobb anyagmennyiségek esetén a racemizáció teljes kivédésére célszerűbb az aktívészteres módszert alkalmazni. E célból előállítjuk az N-p-klórkarbobenzoxi-S-benzil-L-30 ciszteinciánmetilésztert, melynek segítségével magas termelési hányaddal állítható elő az N-terminális dipeptídészter. Minthogy dipeptiddel történő acilezéskor az azidos módszert kivéve, mindig fennáll a racemizáció veszélye az L-izo-35 leucin metilészterrel történő kapcsolásra célszerű a védett dipeptidésztert ismert módon hidraziddá alakítani és az általunk bevezetett egyszerű módon az azidon keresztül elvégezni a kapcsolást. Minthogy a védett tripeptidre is 40 érvényesek a fent elmondottak, ezt is hidraziddá alakítva célszerű kapcsolni a hexapeptiddel. 4. lépés: 45 A védett hexapeptidamid előállítása céljából a 2. alatt leírt középső tripeptidhidrazidot 0° alatti hőmérsékleten aziddá alakítjuk és szobahőmérsékleten kapcsoljuk L-prolil-L-leucil-glicinamiddal. A kapott védett hexapeptidamidot-50 védőcsoportjának eltávolítása után — fenti módon kapcsoljuk a 3. alatt leírt tripeptidhidrazidból nyert aziddal és nyerjük a p-klórkarbobenzoxi-S-benzil-L-ciszteinil-L-tirozil-L-izoleucil-L-glutaminil-L-aszparaginü-S-benzíI-L-cisztemil-55 -L-prolil-L-leucilglicinamidot. 5. lépés: A 4. alatt nyert védett nonapeptidamidot a 60 szokásos izolálás után R—OH általános képletű alkohollal, (ahol R fenti jelentésű) a forráspont hőmérsékletén kezeljük, majd védőcsoportjától du Vigneaud szerint (loc. cit.) folyékony ammóniában fém Na-aí történő kezeléssel szabadítjuk 65 meg.