151935. lajstromszámú szabadalom • Eljárás retroandrosztán-származékok előállítására
3 151935 4 bonsavval észterezve) vagy éterezett hidroxicsoport, mint a tetrahidropiraniloxi-, benziloxivagy trifenilmetoxi-csoport. Előnyös kiindulási anyagok a retropregnán-sor oly 20-ketoszteroidjai, amelyek 3-helyzetben oxo- vagy hidroxicsoportot és legalább 4-helyzetben kettős kötést tartalmaznak, mint a /I4 -9/?,10«-pregnen-3,20-dion (retroprogeszteron) és a /j4 ' 6 -9^,10«-pregnadién-3,20-dion (zl6 -retroprogeszteron). A Fusarium solani tenyésztéséhez és e mikroorganizmus fejlődéséhez táptalajként önmagában ismert tápoldatokat használhatunk, mint amilyenek pl. a nitrogén- és szénforrást, továbbá szervetlen sókat tartalmazó tápoldatok. Nitrogénforrásként példaként megemlítjük a következőket: peptonok, kukoricalekvár, szójatermékek, élesztőkivonatok, aminosavak, proteinhidrolizátumok, nitrátok és ammóniumsók. Szénforrásként asszimilálható szénhidrátok, mint glükóz, szaharóz, továbbá aminosavak jönnek tekintetbe. Szintetikus tápoldatokat is használhatunk. Az oldaliánc leépítésére a találmány értelmében használt mikroorganizmus (Fusarium solani) tenyésztését aerób feltételek mellett folytatjuk, előnyösen a szubmerz eljárásban, pl. rázott tenyészetben vagy kavart és szellőztetett fermentálókban. Példaképpen az alábbiak szerint dolgozunk. A tápoldatot sterilizálás után beoltjuk, pl. a Fusarium solani előzőleg előállított rázott tenyészetével vagy micélium spóraszuszpenziójával, majd 6—72 órán át, előnyösen 24—48 órán át, 15—40 C° hőmérsékleten, előnyösen 24—30 C° hőmérsékleten, szellőztetés közben rázzuk, illetve kavarjuk. Ezen előnövesztés után következik steril feltételek mellett az oxidálandó retroszteroid hozzáadása oldatban, pl. acetonban, metanolban vagy etanolban. Az inkubálási idő 1—8 napig vagy még tovább, pl. legfeljebb 25 napig tarthat. A fermentálás lefolyását próbavétellel és vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal ellenőrizzük. Az eljárás termékeinek izolálása önmagában ismert módon történhet, pl. kromatografálással, ellenáramú eloszlással vagy frakcionált kristályosítással. Az eljárás termékeit gyógyszerkészítési eljárásokban közti termékként használhatjuk. Az eljárás termékei részben maguk is fiziológiás (pl. anabolikus vagy antiandrogen) hatást mutatnak. 1. példa: 20 g szaharózt, 3 g élesztőkivonatot, 1 g glikokollt, 1 g nátriumnitrátot, 1 g primer káliumfoszfátot, 0,5 g magnéziumszulfátot, 0,5 g káliumkloridot és 10 mg vasszulfátot 1000 ml desztillált vízben tartalmazó tápoldat 4 literét rázóedényben 45 percig 120 C°-on sterilizáljuk. Az oldatot, melynek pH-ja 5,0, ezután micélium-spóraszuszpenzióval beoltjuk, melyet Fusarium solani sörcefre ferde agarkul túrájából kaptunk. Az erjedő elegyet szellőzés közben 24—28 C°-on mechanikusan rázzuk. 48 óra el^ teltével -z g /|4 '»-9^,10a-pregnadién-3,20-diont (/l6 -retroprogeszteron) adunk hozzá 40 ml acetonban. Ezután a kultúrát 8 napon át azonos körülmények mellett tovább tenyésztjük. 5 Az előbb leírt módom kapott két kultúrát egyesítjük és a leerjedt folyadékot (összesen 8 liter) a micéliumtól elválasztjuk. A leerjesztett folyadékot előbb 8 liter, azután, háromszor 4 liter ecetészterrel extraháljuk. A leválasztott 10 micéliumot 3 liter ecetészterrel kikavarjuk. Az egyesített kivonatokat vizes 10%-os konyhasóoldattal megmossuk, nátriumszulfáton megszárítjuk és végül csökkentett nyomáson bepároljuk. 15 Az olajos bepárlási maradékot (összesen 4,6 g) 100 ml ecetészter-benzolelegyben (1 : 1) feloldjuk és 5 g aktív szénnel kezeljük. Diatómaföldszűrőn át való szűrés után világossárga, átlátszó oldatot kapunk, mely a rétegkromatogram 20 (benzolaceton 7:3 és 4:1 arányú elegy, szilikagélen) szerint főként ,/!4 ' 6 -9/>,10«-androsztadien-3,17-diont és zl4 ' 8 -9^,10«-anrosztadien-17/?-01-3-ont tartalmaz. A világossárga szűrletet ezután csökkentett 25 nyomáson szárazra pároljuk és 300 ml benzolacetoneleggyel (9 : 1) szilikagélen (Merck 0,05— 0,2 mm) kromatografáljuk. 100, egyenként 10 ml-es frakciót gyűjtünk össze. Minden második frakciót rétegkromatográfiás úton megvizsgá-30 lünk. Az azonos frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Az 1—15 frakciók kevés szennyezést tartalmaznak. A 16—25 frakciók 1,75 g csaknem tiszta zl4 ' 6 -9/',10a-androsztadien-3,17-diont tartalmaznak. 35 Metilénklorid-metanol-izopropiléter elegyből való kétszeri átkristályosítás után ezt az anyagot analitikailag tiszta állapotban 'kapjuk, olvadáspont 193—196 C°; I max. (ultraibolya) = = 285 m/-t; e = 25 700. 40 A 30—34 frakciók 0,21 g J4 ' 6 -9/?,10«-androsztadien-17í?-01-3-ont tartalmaznak, olvadáspont 169—171 C° (metilénklorid-aceton-izpropiléter elegyből való kétszeres átkristályosítás után). "/-• max. (ultraibolya) =285 mi'; « = 27 500. 45 A 26—29 frakciókból az előbb említett 17-hidroxi- és 17-ketonvegyületek elegyéből 0,27 g-ot kapunk. A világossárga olajat 200 ml benzolban feloldjuk és ekvivalens mennyiségű krómsavat adunk hozzá 5%-os ecetsavban. Az elegyet 10 50 óra hosszat rázzuk, ezután a szerves fázist leválasztjuk és ezt vízzel, majd telített nátriumbikarbonát-oldattal és újra vízzel mossuk, végül nátriumszulfáton megszárítjuk és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Ily módon to-55 vábbi 0,19 g /1'1 ' (i -9/?,10a-androsztadien-3,17-diont kapunk. 2. példa: 00 Négy kavaróberendezéssel ellátott erjesztőkészülékbe az 1. példában leírt tápközegből egyenként 6 litert, továbbá habzásgátlószert (szilikonolajat) adunk. A tápközeget sterilizálás után a Fusarium solani 3 napos rázott kultúra-65 jávai beoltjuk és a kultúrát kavarás és szellőzés o
