151797. lajstromszámú szabadalom • Eljárás naftacén-származékok biológiai átalakítására a tetraciklin-sorozatba tartozó antibiotikus hatású vegyületekké
15179? 3 1. példa: A pretetramid (1,3,10,11.12-pentahidroxi-naftacén-2-karboxamid) biológiai átalakítása 6-demetil-tetraciklinné Streptomyces aureofaciens NRRL 3014 törzs felhasználásával: A nem-klórozó Streptomyces aureofaciens NRRL 3014 törzs spóráit steril'desztillált vízzel mostuk le egy ferde agár kultúráról és így olyan spóra-szuszpenziót készítettünk, amely ml-enként 60—80X106 spórát tartalmazott. E szuszpenzióból 0,33 ml mennyiséget alkalmaztunk egy 20 cm-es kémcsőben elhelyezett 8 ml tápközeg beoltására; a tápközeg összetétele az alábbi volt: szacharóz ammóniumszulfát kalciumkarbonát kukoricalekvár csapvízzel feltöltve 30 g 2 g 7 g 20 g 1000 ml-re. A tápközeget beoltás előtt autoklávban sterilizáltuk, 20 percig kb. 1 atm túlnyomás alatt. A beoltás után a kémcsőben levő kultúrát 24 óra hosszat inkubáltattuk 28 C° hőmérsékleten, percenként 116 lökettel dolgozó rázóasztalon. Az ily módon előállított Streptomyces aureofaciens inokulumot az alábbi összetételű táptalajra oltottuk: (NH4 ) 2 S0 4 CaC03 CoCl2 • 6H2 0 NH4 C1 MnSQ4 (technikai, 70%-os) 0,10 g kukoricalekvár 25,0 keményítő 52,5 kukoricaliszt 14,5 6,7 g 9,0 g 5,0 mg 2,0 g csapvízzel feltöltve 1000 ml-re. A fenti táptalajt autoklávban 20 percig sterilizáltuk kb. 1 atm túlnyomás alatt, majd 250 ml-es Erlenmeyer-Iombikban a táptalaj 25 ml adagjait 1,0 ml-es adagokkal oltottuk be a S. aureofaciens inokulumból. A fermentációt 25 C° hőmérsékleten 24 óra hosszat folytattuk, percenként 180 fordulatot végző forgó rázóberendezésben. Ezután a fermentációs lé mindegyik adagját külön-külön átvittük egy-egy olyan lombikba, amely 10 mg pretetramid 1 ml dimetilszulfoxiddal készített oldatát tartalmazta. A fermentációt ezután további 96 óra hosszat folytattuk a forgó rázóberendezésben, 25 C° hőmérsékleten. Ekkor megelemeztük a fermentációs levet és azt találtuk, hogy az 15 mcg/ml 6-demetil-tetraciklint tartalmaz. Az ugyanilyen módon, de pretetramid hozzáadása nélkül lefolytatott ellenőrző kísérlet során nem találtunk 6-demetil-tetraciklint a fermentációs termékben. 2. példa: A pretetramid (1,3,10,11,12-pentahidroxi-naftacén-2-karboxamid biológiai átalakítása 7-klór-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 -6-demetil-tetraciklinné Streptomyces aureofaciens. NRRL 3013 törzs felhasználásával: Az 1. példában leírthoz hasonló módon dolgoztunk, az alábbi eltérésekkel: A klórozó hatású Streptomyces aureofaciens NRRL 3013 törzzsel részlegesen fermentált levet lombikonként oly lombikba vittük át, amelyek 11,4 mg pretetramidot tartalmaztak, 10 mg magnéziumacetát és 1 ml dímetilszulfoxid elegyében oldva. A fermentációt azután 96 óra hosszat folytattuk a forgó rázóberendezésben 28 C° hőmérsékleten. Ezután megelemeztük a fermentációs levet és azt találtuk, hogy az 85 mcg/ml 7-klór-6-demetil-tetraciklint tartalmaz. Az ugyanilyen módon, de pretetramid hozzáadása nélkül lefolytatott ellenőrző kísérlet során nem találtunk 7-klőr-6-demetil-tetraeiklint a fermentációs termékben. 1 3. példa: A 6-metil-pretetramid biológiai átalakítása 7-klór-tetraciklinné Streptomyces aureofaciens NRRL 3013 törzs alkalmazásával. A Streptomyces aureofaciens NRRL 3013 ferde ágártenyészeten termelt spóráit desztillált vízzel lemostuk és ily módon egy ml-enként 60—80X106 spórát tartalmazó szuszpenziót készítettünk. E szuszpenzióból 0,33 ml-t használtunk fel egy 20 cm-es kémcsőben elhelyezett 8 ml inokulum-közeg beoltására. Az inokulum összetétele és az inkubáltatás módja teljesen megegyezett az 1. példában leírttal. Az ily módon kapott S. aureofaciens inokulummal ugyanoly módon elkészített táptalajt oltottunk be, amilyent az 1. példában leírtunk. A táptalaj sterilizálása után 25 ml-es adagokat vittünk be egy-egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba és ezeket a S. aureofaciens inokulum 1 ml-es adagjaival oltottuk be. A fermentációt 25 C° hőmérsékleten 24 óra hosszat folytattuk egy percenként 180 fordulatot tevő forgó rázóberendezésben. Ezután a fermenációs lé mindegyik adagját külön külön átvittük egy-egy oly lombikba, amely 10 mg 6-metil-pretetramidot tartalmazott ammóniumhidroxiddal meglúgosított dimetilszulfoxid 1 ml-jében oldott állapotban. A fermentációt további 96 óra hosszat folytattuk a forgó rázóberendezésben 25 C° hőmérsékleten. Az ezután biológiai módszerrel végzett meghatározás azt mutatta, hogy a fermentációs termék baktériumellenes aktivitása 180 mcg/ml 7-klór-tetraciklin tartalomnak felel meg. A terméknek a 7-klór-tetraciklinnel való azonosságát papírkromatográfiai úton is megállapítottuk, butanolos pH = 3 foszfát-tompító rendszerben. Az ugyanilyen módon lefolytatott ellenőrző fermentációs kísérletben, amikoris csupán dimetilszulfoxidot adtunk a fermentációs léhez, 6-metil-pretetramid nélkül, a fermentációs termékben nem találtunk 7-klór-tetraciklint. 4. példa: A 6-metil-pretetramid biológiai átalakítása 7-65 -klór-tetraciklinné Streptomyces aureofaciens 4
