151724. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szaprofita kulturában anyarozs alkaloidokat termelő Clavicepstörzsek szelektálására és fenntartására
151724 é a termelő egyedek feldúsítása idején a 48—72 órában, tiszta tenyészet fenntartásakor 6—8 naponként történik. A találmány szerinti törzsizolálás célszerű és gyors módja az, hogy az egyes szélesztések között a rázott kultúrában történő szaporítást is a törzs fenntartásánál alkalmazott szelektív táptalajon végezzük. Ez az eljárás első fázisában biztosítva az alkaloidtermelő egyedek viszonylag gyorsabb szaporodását, növeli azok hányadát, így egyben megjelenésük valószínűségét is és lehetővé teszi, hogy kevesebbszer ismételt szélesztés után nyerjünk szaprofita módon alkaloidot termelő tiszta egytelep tenyészetet. A fenti eljárásokkal izolált és fenntartott egytelep tenyészet ugyan már ebben az állapotban is jó eredménnyel alkalmazható anyarozsalkaloidok ipari körülmények között történő szaprofita termelésére, de az egytelep tenyészetek jellegüknél fogva sem tekinthetők homogén, genetikailag is egységes kultúráknak és így fennáll a lehetősége — visszamutálás nélkül is — a tenyészet nem termelő egyedekkel való szennyezettségének, ami a törzs további fenntartására, vagy a termelésre való alkalmazása során a termelőképesség romlására adhat alkalmat. Előnyös ezért, ha a találmány szerinti eljárással szelektált egytelep-tenyészetből genetikailag is egységesnek tekintendő [ (M. Jung, H. Rochelmeyer: Beiträge zur Biol, der Pflanzen, 35, 343, 1960) egykonidium-kultúrát tenyésztünk ki. A szaprofita módon alkaloidot termelő törzsek általában gyengén, vagy nem képeznek konidiumot, ha azonban az alkaloidtermelésre használt táptalajt kiegészítjük túlnyomórészt szerves nitrogén-vegyületeket tartalmazó természetes táptalaj-adalékokkal, — amilyen a pepton, kukoricalekvár, szójaliszt, siker — intenzívebb vegetatív szaporodást és több-kevesebb konidiumképzést idézhetünk elő. A hifaszövedék nagy részét szűréssel eltávolítva a kapott konidium-szuszpenzióból valamely ismert módon egysejt-tenyészetet állítunk elő. Az egykonidiumtenyészet fenntartása az egytelep-tenyészet esetében fent leírt módon történik, esetleges revertánsök képződését időközönként ismételt — differenciáló agar táptalajra történő — szélesztéssel ellenőrizzük. 1. példa: Ba jelű, hazai eredetű szkleróciumból malátakivonattal készített ferde agáron a gombát kitenyésztjük, ebből ismert '(Proc. Roy. Söc. B. 155, 26, 1961.) alkaloidtermelésre alkalmas táptalajon rázottkultúrát készítünk. A tenyészetet 7. napon homogenizálva 1 : 10 000 és 1 : 1 000 000 hígításban alábbi differenciáló táptalajra szélesztjük: szaharóz 0,05% keményítő 2,00% KH2PO4 0,25% NH4CI 0,10% agar-agar 1,80% pH 6,8 Az agar felületéről 12 nap után a lilásféhér izolált telepek mindegyikéről azonos összetételű ferde agárra leoltunk, 8 nap után a színképzést ellenőrizzük és a tenyészetet lemosva az előbbi 5 folyékony táptalajra oltjuk. A lombikot rázóasztalon inkubáljuk, 6 nap után a tenyészetet homogenizálva és hígítva ismét szélesztjük. Öt hasonlóan elvégzett szélesztés után, amikor fehér telepek már nem jelentkeznek, a ferde 10 agárról 1% Witte peptonnal kiegészített folyékony táptalajra oltunk, a tenyészetet a 10. napon vásznon sterilen szűrjük és a konidium-szuszpenzióból függőcseppkultúra segítségével egykonidium-tenyészetet izolálunk. 15 Az egyes szélesztések között a rázottkultúra mintájából alkaloid-extrahálást és meghatározást végzünk, (Österr. Chem. Ztg. 63, 300, 1962.) az alkaloidkoncentráciők a telepenkénti szórással a következők: 20 I. szélesztés után 1> y/ml — 10 y/ml II. szélesztés után 1> y/ml — 18 y/ml III. szélesztés után 15 y/ml — 75 y/ml IV. szélesztés után 40 y/ml — 90 y/ml 25 V. szélesztés után 70 y/ml — 90 y/ml . A kiválasztott egykonidium-tenyészet alkaloid termelése 6 nap alatt, rázottkultúrában 110 gamma/ml. 30 2. példa: C III jelű, német eredetű szkleróciumból kitenyésztett gombát a fenti folyékony táptalajon 35 és az alábbi szilárd táptalajon három ismételt alkalommal szelektálunk. burgonyakivonat 50,0% i(nedves burgonyára számítva) 40 kukoricalekvár 0,2% KH2 P0 4 0,1% agar-agar 2,0% pH 6,8 Az alkaloidérték változása a következő: I. szélesztés után 0 y/ml -8 y/ml II. szélesztés után 12 y/ml — - 20 y/ml II. szélesztés után 16 y/ml — - 20 y/ml 45 50 3. példa: Az OKI 620125 1. sz. törzset ( sz. magyar szabadalmi leírás, Rí—246 alapsz. bej.) a leírásban megadott módon és táptalajon tar-55 tottuk fenn sorozatos átoltással. Két hónap alatt a tenyészet alkaloidtartalma több, mint 1/10-ére, 20 gamma/ml-re csökkent. Ebből a termelő'készségét fokozatosan elvesztő tenyészetből szélesztést végzünk az alábbi táptalajra: 60 keményítő 2,0%, triptofán 0,1% KCl 0,1% <(;NH4 )2ÍHP04 0,2%, 65 agar-agar 1,8% pH 6,8 3
