151724. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szaprofita kulturában anyarozs alkaloidokat termelő Clavicepstörzsek szelektálására és fenntartására

3 151724 4 lizergsavamidot termeltek. Ismételten hangsúlyozzák, hogy ezt a kémiai képességet csak bizonyos ritka fajták mutatják és ezeknél is a törzs továbbtenyésztése során mutáció, vagy tartós modifikáció léphet fel, amikor a fáradságosan szelektált alkaloidtermelő-képesség ismét elvész. Az irodalmi adatok és gyakorlati tapasztalatok tehát egyaránt arra mutatnak, hogy az elért eredmények ipari hasznosítása éppen azért nem sikerült, mert a szaprofita körülmények között alkaloidtermelő törzsek, ha, igen ritka esetekben alkaloid-összetétel és hozam szempontjából is megfelelőnek ígérkeztek, termelőképességüket a szaporítás, ill. további fenntartás során viszonylag rövid idő alatt részben vagy teljesen elvesztették. Ezeket a szaprofita alkaloidtermelés ipari megvalósítását eddig gátló nehézségeket szünteti meg a jelen találmány, amely lehetőséget biztosít bármely Claviceps-tenyészetből a szaprofita alkaloidtermelésre képes egyedek kiválasztására és egykonidium-kultúra alakjában való kinyerésére, másreszt az így nyert törzs termelőképességériek megfelelő fenntartására. A szaprofita alkaloidtermelésre képes törzsek kiválasztása á találmány szerinti eljárással szelekció útján történik rozsról származó kezeletlen, ún. vad Claviceps-kultúrából, vagy valamely mutagen behatással előzetesen kezelt kultúrából. A vad kultúrák ugyanis kisebb, a mutagen kezelt tenyészetek viszonylag nagyobb hányadban mindig tartalmaznak a tenyészet általános tulajdonságaitól eltérő biokémiai viselkedést mutató mutánsokat, közöttük szaprofita alkaloidtermelésre megfelelő hozammal és tartósan képes mutáns-törzseket is. Ezeket abban az esetben tudjuk kitenyészteni, ha megfelelő módszerrel rendelkezünk a termelő mutáns kiválasztására, tehát igen nagyszámú egyed gyors és megbízható levizsgálására, és biztosítani tudjuk a termelőképesség fenntartásának feltételeit. E feladatok megoldását a következő felismerések tették lehetővé: szaprofita körülmények között alkaloidtermelésre képes törzsek megfelelő táptalajon szélesztve jellemző pigmentet termelnek és így a telep színe alapján a nem termelő törzsektől biztonsággal megkülönböztethetők. Az ily módon kiszelektálható törzs termelőképessége gyakorlatilag korlátlanul fenntartható, sőt fokozatos kiválasztódás folytán mindinkább stabilizálható egy olyan törzsfenntartó táptalajon, mely kedvező feltételeket biztosít az alkaloidtermelő mutáns szaporodására, ugyanakkor gátolja a visszamutálás következtében keletkező, alkaloidot nem termelő revertánsok szaporodását. A kiinduló kultúrát a találmány értelmében egy differenciáló táptalajon szélesztjük; a táptalaj szénforrásként túlnyomórészt vagy kizárólag poliszacharidokat (kevés, vagy semmi mono-, ill. diszacharid mellett) szerves vagy szervetlen nitrogénforrást, szervetlen sók között jellemzően K és PO4 sókat tartalmaz, 6,5 feletti, célszerűen 6,8-ra beállított pH-érték mellett. Az ilyen összetételű táptalajon a szaprofita módon alkaloidot termelni képes törzsek telepei narancslila színben tűnnek fel, az alkaloid-negatív 5 törzsek tiszta telepei fehér színűek maradnak, végül a vegyes telepek megfelelően halványabb színeződést, vagy színes szektorképződést mutatnak. Ugyanezen törzsek telepei sok más táptalajon (pl. maláta, élesztő vagy húsléagáron) 10 nem különböztethetők meg egymástól. Az alkaloidtermelésre használt cukor^borostyánkősavas táptalajon felléphet pigmentképzés, azonban Taber és Vining '(Can. J. Microbiol. 4, 611, 1958.) megállapíottták 41 különféle törzset hasz-15 nálva, hogy az itt kapott pigmentáció és az alkaloidképző képesség között nincs összefüggés, vagy az legalábbis nem mondható általános érvényűnek. A találmány szerinti összetételű differenciáló táptalajon a színeződést 20 okozó pigmentek domináló komponensei — pH 6,0—7,0 érték között átcsapó, indikátor jellegű sárga-narancs, ill. narancs-lila festékanyagok — az alkaloidtermelő készséghez kapcsolt jellemzői a gombának. Szaprofita körülmények között "5 alkaloidot nem termelő törzsek rozson, tehát parazita módon az alkaloidképzéssel egyidőben, papírkromatográfiás azonosítás szerint, ugyanezen színanyagokat termelik. A telepek szín szerinti kiválasztása lényege-30 sen gyorsabb, mint az eddig alkalmazott eljárások, hol a telepeket egyenként folyékony táptalajra oltották és 6—60 napi inkubálás után a kapott tenyészeteket alkaloidtartalomra vizsgálták. Az eljárás fontos előnye egyszerű-3^ sége és gyorsasága mellett, hogy az alkaloidtermelő egyed vegyes telepben is felismerhető, amikor ugyané telep tenyészete mérhető alkaloidértéket még nem ad. Az első szélesztés szkleróciumból vagy micéliumos tenyészetből túF-40 nyomórészt vegyes telepben tartalmazza az alkaloidtermelő mutánsokat, az eddigi eljárásokkal tehát ezeket a mutánsokat legtöbbször fel sem ismerték. A vegyes telepek tenyészete a továbbiakban 45 ismételt szélesztésre szorul, ezért azt valamely ismert, alkaloidtermelésre alkalmas folyékony táptalajra leoltjuk, rázóasztalon inkubálva elszaporítjuk, majd a kapott hifaszövedéket turmix-géppel felaprítva megfelelő hígításban ís-50 mét a fent említett összetételű táptalajra szélesztjük. Az eljárást mindaddig ismételjük, amíg csak fehér, vagy vegyes telep is jelentkezik az agárlemezen. A kiszelektált törzset azután a találmány ér-55 telmében olyan folyékony táptalajon tenyésztjük tovább, ül. tartjuk fenn, amely valamely szerves szénforrás (poliszacharid, cukor, szerves sav) és szervetlen sók mellett 0,01—3,0% koncentrációban glicint is tartalmaz. Az alkaloid-60 termelő törzs fejlődését a glicin, a kontroll (glicin nélküli) tenyészethez képest 2—3-szorosára fokozza, míg a! nem termelő tenyészet növekedése glicin jelenlétében — az elérhető szárazmicélium-súly alapján — közel 1/10-ére 65 csökken. A gomba átoltása a glicines táptalajon 2