151420. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteolitikus enzimek előállítására
Í5 151420 1« Á fent leírt eljárás egymagában való alkalmazása csak olyan \esetekben volt kielégítő, amikor csupán a proteázok egymástól való elválasztása és a szennyezések legnagyobb részének eltávolítása volt a célunk. A proteázok to-, vábbi tisztítása azonban csupán dietilaminoetilcellulózon végzett ioncserélő-kromatógráfiával volt megoldható. Ez a további tisztítás az alábbi módon került kivitelezésre: 4. példa: Ioncserélő-kromatografálás A dietilaminoetil-cellulóz ioncserélőt vagy cellulózporból állítottuk elő Peterson és Sober módszerével, vagy pedig készen szereztük be a kereskedelemben. A felhasznált anioncserélő adszorbensek teljes ioncserélő kapacitása 1 g száraz súlyra számítva 0,4—0,6 milliekvivalens " volt. A dietilaminoetil-cellulóz ioncserélőt az oszlopba való bevitel előtt kb. tízszeres térfogatú, megfelelő pH-értékű 0,5 mólos foszfát-tompítóoldatban szuszpendáltuk és szobahőmérsékleten 1 óra hosszat élénken kevertük. A cellulózt azután fél óra hosszat ülepedni hagytuk, majd az oldatot a legkisebb részecskék elkülönítése céljából dekantáltuk. Az adszorbenst azután többízben mostuk 6,0 pH-értékű 0,01 mólos foszfát-tompítóoldattal (ez volt az első lépésben alkalmazott tompítóoldat), majd ismét szuszpendáltuk ugyanebben a tompítóoldatban. Az egyensúly beállása céljából éjjelén át állni hagytuk, majd az adszorbenst tartalmazó szuszpenziót a kívánt célnak megfelelő méretű, üvegből készült kromatografáló oszlopba öntöttük be. Az adszorbenst gravitációs hatás alatt ülepedni hagytuk, majd levegőnyomással tovább tömörítettük, míg állandó oszlopmagasságot nem értünk el. Az egyensúly teljes beállásának biztosítása céljából az oszlopot 25—30 tf. tompítóoldattal mostuk mindaddig, míg a lefolyó oldat pH-értéke a betáplált tompítóoldatéval teljesen meg nem egyezett.. A kromatografálandó termékeket előzőleg dializáltuk, a kezdeti tompítóoldattal szemben. Az itt leírt elválasztási műveletek többségét fokozatos eluálással végeztük, amint ez az ábrán látható. A frakciók állandó térfogattal történő felfogására egy e célra alkalmas frakciógyűjtőt használtunk. A fehérjék eluálásának menetét oly módon ellenőriztük, hogy a lefolyó oldatok optikai sűrűségét mértük 280 millimikronnál. „Az eluálás menetét könnyebben kísérhettük figyelemmel, ha e célra ibolyántúli abszorpció-mérőt és regisztráló mérőműszert alkalmaztunk. Ily módon folytonos grafikus regisztrálást tudtunk végezni 254 millimikronnál a lefolyó oldat abszorpciójáról, anélkül, hogy az egyes frakciókat külön kellett volna e célból felfogni és megelemezni. Az egyes különálló csúcsértékeknek megfelelő terméket tartalmazó frakciókat egyesítettük, hideg vízzel szemben dializáltuk és ezt követően liofilizáltuk, vagy közvetlenül tanninnal csaptuk le a fehérjéket. . A kapott termékeket 5 papír-elektroforézissel elemeztük és meghatároztuk fajlagos proteolitikus aktivitásukat. Kisebb frakciókat Mies-féle kollódium-membránon keresztül történő ultra-szűrés útján is koncentráltunk. A Membranengesellschaft göttlin-10 géni cég által' szállított kollódium-zacskókat alkalmaztunk erre a célra. A dietilamino-etil-cellulózt felhasználás után oly módon regeneráltuk, hogy először 0,5 mól nátriumkloridot és ugyanilyen koncentrációjú 15 nátriumhidroxidot tartalmazó oldattal mostuk, majd nagy mennyiségű vízzel semleges pH-értékre mostuk az adszorbenst. Hosszú idő óta folyt már kutatómunka oly hatásos szerek előállítására, amelyek alkalma-20 sak az intravaszkuláris fibrin-lerakódások gátlására és a véredényeknek a már képződött thrombusok teljes vagy részleges lebontása útján történő felszabadítására. Az ismert valóságos antikoaguláns szerek, mint a heparin, fel-25 használhatók a képződött rögök további szaporodásának, ill. terjeszkedésének meggátlására, a már képződött thrombusokat azonban ezek a szerek nem roncsolják el és így irreverzibilis "* véredény- és szövet-elváltozások következnek 30 be. Ezért az „in vivo" fibrinolízis igen lényeges lépést képez a trombózisok gyógykezelése terén. Az olyanfajta termékek, mint a plazmin és a sztreptokináz jó eredményeket ígértek ugyan, 35 ezek azonban nem voltak egyértelműek és így az ilyen anyagok egyike sem váltja valóra a hatásos trombolitikus szerekkel szembeni öszszes követelményeket. Az I proteáz azonban olyan anyag,' amely antikoaguláns hatásossága 40 mellett erős proteolitos fibrinolitikus hatással is rendelkezik; ezzel a termékkel önmagában, vagy pedig a II proteáz és III proteáz egyikével vagy mindkettejével kombinálva igen jó eredményeket tudtunk elérni. 45 Az I és II proteáz, úgyszintén bizonyos mértékig a III proteáz; is gyorsan fel tudja oldani az emberi vagy állati eredetű fibrin-olvadékokat. Feloldják a plazmaolvadékokat is, ebben az esetben azonban kimutatható a szérum gátló 50 hatása. Ez utóbbi esetben tehát nagyobb menynyiségű enzimet kell alkalmazni ahhoz, hogy olyan gyors oldódást érjünk .el, mint szérum távollétében. Széleskörű kísérleteket végeztünk különösen 55 az I proteázzal; hatásos olvadék-feloldást és a véredények újbóli megnyílását tapasztaltuk. Különböző módszerek, pl. venográfia, a J133-tartalmú fibrin-olvadékok csökkenő radioaktivitásának mérése, valamint a thrombus által el-60 zárt véredény közvetlen vizuális vizsgálata útján is kimutatható az olvadékok oldódása. Nyulakon, macskákon és kutyákon nagy kísérletsorozatokat végeztünk; a macskákon végzett kísérletek eredményeit az alábbi III. táblázat-65 ban foglaltuk össze. R
