151420. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteolitikus enzimek előállítására
151420 9 Az egyes enzimek parciális aktivitását oly módon határoztuk meg, hogy a proteázofcat 4,5, 6,0 és 8,5 pH-értéken végzett folytonos eléktrof orézissel elkülönítettük egymástól. Az egyes frakciókat a kazeináz-módszerrel vizsgáltuk r §ß és 7,4 pH-értéknél. A kapott értékeket a teljes aktivitás százalékarányában kifejezve az alábbi II. táblázatban foglaltuk össze: II. táblázat Alkotórész I pro- II' proteáz teáz III proteáz kazeináz pH 6,0 7,4 6,0 7,4 •6,0 7,4 elektroforézis 4,5 pH-nál 29,0 66,0 / 23,5 34,0 47,5 — 6,0 pH-nál 28,5 65,0 24,0 35,0 47,5 — 8,5 pH-nál — 65,0 — 35,0 __ _ A II. táblázatban szereplő értékek szemmelláthatöan igen jól egyeznek az I. táblázatban megadott értékekkel, annak ellenére, hogy különböző módszerekkel jutottunk ezekhez az értékekhez. Az eléktroforézises elemzés adatai világosan mutatják, hogy az Aspergillus oryzae kultúrából kapott nyers énzimkészítményben háromféle proteáz van jelen. A protein-elegy azonban sokkal bonyolultabb összetételű volt, mint ahogyan ezt az eléktroforézises vizsgálat mutatta. Más pH-értékeken végzett, ismételt eléktroforézises vizsgálatok megmutattak, hogy a kapott • különböző frakciók sem álltak egy-egy egységes fehérjéből, hanem bonyolult elegyekkel álltunk szemben. Az egyes proteázokat azonban el lehetett különíteni és mennyiségi arányukat is meg lehetett állapítani. Az ilyen eléktroforézises vizsgálatok analitikai célokra alkalmasak lehetnek ugyan, nagyobb mennyiségű anyagokkal végzett műveletekhez azonban nem használhatók. Ügy latszik azonban, hogy az ioncserélő-kromatográfia jól használható a proteolitikus enzimek frakcionálására és tisztítására, még oly esetekben is, amikor az ilyen rendszerek bonyolult szerkezetéből származó nehézségek egészen más jellegűek és mértékűek, mint a kevésbé bonyolult anyag-elegyek kromatográfiai szétválasztása esetén. A vizsgált enzimek csekély stabilitása nagymértékben korlátozza a felhasználható eluálószerek körét és különleges kísérleti körülmények alkalmazását teszi szükségessé; így pl. alacsony hőmérsékleteken és korlátozott pH-tartományon belül kell dolgozni. Az ioncserélő gyanták használatával járó legfontosabb nehézség abból ered, hogy ezek irreverzibilisen kötik meg a fehérjéket. Ennek oka az lehet, hogy túlságosan sok kötés képződik a fehérje és az adszorbens gyanta között és e sok kötés nem egyidejűleg disszociálődik, csupán ha olyan feltételeket alkalmazunk, amelyek már lebontják a molekula eredeti konfigurációját. A nia már hozzáférhető cellulóz- és dextránalapü adszorbensek bizonyultak a legjobbaknak mind a folyadékáramlással szembeni viszonylag kis. ellenállásuk, mind pedig a viszonylag láza 5 fehérje-kötésük szempontjából. Ezek az anyagok mind anioneserélő, "mind kationcserélő tulajdonságokkal rendelkezésre állnak; mindkét típust felhasználtuk a proteázok kromatografálása során. Az adszorbeált fehérje szorosan '10 kötődik ezeken áz adszorbenseken és kétségkívül többszörös elektrosztatikus kötés jön létre a fehérje és az adszorbens között az adszorpció folyamán. Az eluálás azáltal válik lehetségessé, hogy a pH-értéket megváltoztatjuk és ezzel 15 csökkentjük a fehérje vagy az adszorbens töltéseinek számát, vagy pedig növeljük a sókoncentrációt, hogy az ellensúlyozza a fennálló töltéseket. A nyers proteáz-elegyeket dietilaminoetil-3S0 cellulózzal töltött, 3,0 X 40 cm méretű oszlopokon kromatografáltük, 0,01 mólos foszfát-tompítóval 6,0 pH-órtékre tompított állapotban; 2 g dializáit anyagot oldottunk 15 ml tompító oldatban és ezt vittük fel az oszlopra, 0,5 ml 2S térfogatú frakciókban, A C° hőmérsékleten. E kromatográfiai művelet eredményeit grafikusan • a 2. ábrán mutatjuk be. Ezen az ábrán az összefüggő vonal a 280 millimikronnál mutatkozó abszorpciót szemlélteti. A sraffozott szakaszok 3® a viszonylagos kazein-aktivitást mutatják 6,0 pH-értéknél. . Az eluálószer só-koncentrációját lépésenként változtattuk, az ábrán 1—5 számokkal jelzett pontoknál; az alkalmazott koncentrációk az 35 alábbiak voltak: 1. 0,01 mólos foszfát-tompító 2. 0,10 mólos foszfát-tompító 3. 0,25 mólos foszfát-tompító 4. 0,50 mólos foszfát-tompító 5. 0,50 mólos foszfát-tompító NaCl-oldat. v Ezek a kísérletek azt mutatják, hogy a nyers termék legalább 8 különálló csúcsértékre bont-4§ ható szét, ezeket eluálásuk sorrendjében A—H betűkkel jelöltük. A fehérjék eluálásának menetét oly módon ellenőriztük, hogy mértük az egyes frakciók 280. millimikronnál mutatott optikai sűrűségét. Az eluált frakciókat proteose litikus aktivitásuk szempontjából is vizsgáltuk. Az itt leírt eluálási módszer esetében a kromatográfiai csúcsértékek helyzete mind az analitikai, mind a preparatív oszlopok esetében igen. jól reprodukálható volt, Az újbóli kromatográfia 55 során a proteáz^frakciók mindegyikét az egyes Csúcsértékeknek megfelelően külön eluáltuk, ugyanolyan só-koncentrációval, mint az első kísérlet során. Az újbóli kromatográfia során a frakciók viselkedésé azt mutatta, hogy való-60 ban hatásos frakcionálási sikerült elérnünk. Az előzetes vizsgálatok azt mutatták, hogy három különböző proteáz van jelen a nyers elegyben; ezt az ioncserélőkromatográfia. eredményei is megerősítették. A fehérje-elegy azon-SS ban bonyolultabbnak bizonyult, mint az előze-40 0,50 mólos s
