151420. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteolitikus enzimek előállítására

151420 11 11 tes elektroforézises vizsgálatok szerint. Az előzőek során I, II és III proteáznak nevezett három proteolitikus enzimet az A, E és G csúcsértékeknek megfelelő frakciókban találtuk meg. A többi csúcsértéknek megfelelő frakciókban is találtunk fehérjéket, ezeket azonban nem jellemeztük. Az oszlopra felvitt anyag proteolitikus aktivitásának kb. 85—95%-át nyertük vissza a frakcionált termékekben, ha a szétválasztást alacsony hőmérsékleten (4 C°) végeztük. A fent leírt ioncserélő kromatográfiás eljárást eléggé nagy anyagmennyiségek szétválasztására tudtuk alkalmazni, a módszer azonban eléggé időtrabló és ipari méretű műveletekhez nem alkalmazható. Ilyen nagyobb méretű műveletek is elvégezhetők azonban, ha többfokozatú szakaszos eljárással dolgozunk és karboximetil-cellulóz kationcserélőt alkalmazunk. Ilyen módon a nyers készítményt a proteázok, ill. a proteáz-aktivitás számottevő vesztesége nélkül frakcionálhatjuk. A szétválasztott proteázok és a jelenlevő egyéb fehérjék további szétválasztását ugyanilyen típusú külön oszlopokon, megváltoztatott feltételek mellett, vagy pedig másfajta cellulóz-ioncserélők felhasználásával folytathatjuk le. Az I, II és III proteázok mennyiségileg adszorbeálódnak a kationcserélő karboximetilcellulózon 5,5, ill. 3,0 alatti pH-értékeknél; ezt a 3. ábra szemlélteti, amelyen a —o-—o—o— /ónál. az I proteáz adszorpciójának menetét, a —O'—o>— o— vonal a II proteáz adszorpciójának menetét, a —A—A—A— vonal pedig a III proteáz adszorpciójának lefolyását szemlélteti. A szétválasztást általában az alábbi módon végeztük: kiindulóanyagként tanninnal lecsapott proteáz-készítményeket alkalmaztunk és ezeket a ,6,5 alatti pH-értéknél vízben oldottuk 2 g/liter végső koncentrációig. Ezután az oldatot 5,5 pH-értékre állítottuk be és szobahőmérsékleten kevertük a poliszacharid-származék ioncserélővel. Miután az első gyanta-adaggal az egyensúly beállt, az oldatot centrofugálás útján elkülönítettük. Bár a fehérjét adszorbeálva tartalmazó ioncserélőt centrif ugálással el tudtuk választani az oldat főtömegétől, az ioncserélő mégis számottevő mennyiségű folyadékot tartott vissza és e folyadék természetesen az ioncserélővel nem reagált fehérjéket is tartalmazott. 0,01 módos foszfát-tompítóoldattal 5,5 pH-értéknél végzett mosás segítségével távolítottuk el a nem-adszorbeált anyagot, anélkül, hogy ezzel egyidejűleg az adszorbeált fehérjéket is eluáltuk volna. Az egyesített oldatokat ezután 4,5 pH-értékre állítottuk be és a fenti eljárást ezen a pH-értékeri megismételtük a II proteáz elválasztása céljából, majd 3,0 pH-értéken ismét megismételtük, a III proteáz elválasztására. Tekintettel arra, hogy az ioncserélőnek oly mennyiségben kell jelen lennie, hogy az oldatban levő összes proteázt adszorbeálni. tudja, a poliszacharid-karboximetil-származékot nagy feleslegben alkalmaztuk. Az eluálás, az adszorpcióhoz hasonlóan, várható módon szintén függvénye a pH-értéknek. A proteázok eluálását oly módon végeztük, hogy az adszorbeált anyagot tartalmazó adszorbenst 5 magasabb pH-értékű tompító-oldatokkal kevertük, mint amilyen^ pH-értéken az adszorpció • történt. Annak érdekében, hogy elkerüljük a proteázoknak a pH-érték nagyfokú változása folytán bekövetkező inaktíválódását^ legcélsze-10 rűbbnek az bizonyult,- hogy 0,05 mólos, 7,0 pH-értékű foszfát-tompítóoldatót alkalmaztunk az I és II proteáz eluálására, 6,0 pH-értékű tempi tóoldatot pedig a'III proteáz eluálására. Ismételt eluálással az eredeti proteolitikus aktivitás 15 90%-ot meghaladó részét tudtuk visszanyerni. A visszanyerés százalékaránya kis- és nagymennyiségű proteázokkal dolgozva egyaránt igen jó volt. Ezt a magas hozamot azzal sikerült elérni, hogy a proteázokat az enzimek 20 számára kedvező* körülmények között eluáltuk. így pl. a III proteázt, amely 6,5 pH felett nem stabil, 6,0 pH-értéknél eluáltuk. E munkamódszer enzimek esetében való jó alkalmazhatóságának egy másik tényezője, hogy mind az ad-25 szorpció, mind az eluálás gyorsan megy végbe. Ezért ezt a módszert kis mennyiségekkel dolgozva, analitikai eljárásként is jól lehet alkalmazni. A legtöbb esetben szükségesnek bizonyult az 30 eluátumok' koncentrálása, tárolás vagy további, más módszerekkel történő tisztítás céljaira. Ez; a proteázok tanninnal való lecsapása útján, amint ezt fentebb már ismertettük, vagy pedig dialízis és ezt követő liofilizálás útján volt vég-35 rehajtható. A" frakcionálási művelet hatásosságának, valamint a termékek további tisztításának céljaira dietilaminoetil-cellulózon vagy dietilaminoetil-dextránon végzett kromatográfiai alkal-40 mázhatunk. Ez ugyanolyan feltételek m.ellett folytatható le, mint ahogyan ezt fentebb leírtuk. Kimutatható volt, hogy a karboximetil-cellülózzal végzett szele^ív adszorpció útján hagy-45 mértékben tisztított I proteázhoz jutunk. Az így kapott termék igen kis mennyiségben tartalmaz csupán inaktív fehérjét. A II és III proteáz is nagymértékben tisztított állapotban nyerhető ki, ezek a termékek , azonban még 50 egyéb fehérje-alkotórészéket is tartalmaznak. Ezeket is kielégítő mértékben tisztíthatjuk azonban tovább, ha a fent említett módon dietilaminoetil-poli-szacharidokon kromatografáljuk őket tovább. 55 A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik. 60 1. példa: Az enzimek előállítása Az Aspergillus oryzae enzimjeit fehérjében és szénhidrátban gazdag tápközegben történő 65 alámerülő tenyésztéssel teemeltük. A legna-