151420. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteolitikus enzimek előállítására
7 151420 8 mázó szervetlen vegyületek stb. Bár a fehérjehidrolizáló enzimek aktivitása eléggé nagy volt ahhoz, hogy pontosan mérhető legyen, az oldat teljes fehérje-koncentrációja túlságosan csekély Vjolt ahhoz, hogy a ' szokásos módszerekkel, pl. ammóniumszulfátos kisózással vagy szerves oldószerekkel való lecsapással hatásosan tisztítani lehessen. Számos tisztítási módszerrel tettünk kísérletet és úgy találtuk, hogy Legjobb eredményekhez akkor jutunk, ha kezdeti műveletként a fehérjéket, beleértve a • proteolitikus enzimeket is tanninnal szelektíven lecsapjuk az oldatból, majd a tannint acetonos mosással távolítjuk el a csapadékból. A proteáz-lecsapás hatásosságát megszabó legfontosabb tényezők: a tannin-koncentráció, a pH-érték és a hőmérséklet. A tannin koncentrációja és a lecsapott proteinek mennyisége közötti üsszefüggést, valamint a hozamnak a pH-értéktől és a hőmérséklettől való függését előzetes kísérletek segítségével állapítottuk meg. Ezek eredményei alapján az alábbi módszert alkalmaztuk a proteázokat tartalmazó fehérjeelegy feldúsítására. A kitenyésztett kultúra szüredékét 5,5 pH-értékre állítottuk be. A proteázok csaknem mennyiségi lecsapását olyan mennyiségű tannin hozzáadásával értük el, hogy a tannin végső koncentrációja a szüredékben 3,0 g/1000 ml legyen. Az elegyet a lecsapás után legalább 2 óra hosszat állni, hagytuk szobahőmérsékleten, majd a csapadékot centrifugálás útján elkülönítettük és a tannintól oly módon mentesítettük, hogy ismételten acetonban diszpergáltuk és centrifugáltuk a csapadékot, majd végül a tannintól mentesített csapadékot exszikkátorbah megszárítottuk. Az így kapott nyers proteáz-elegy igen érzékeny a további tisztítási műveletekkel szemben. A száraz por egy évnél hosszabb ideig is megtartotta proteolitikus aktivitását. Ez a nyers termék vízben jól oldódik, ugyanígy sóoldatokban is; ezen az úton oly proteáz-oldatok voltak készíthetők, amelyek proteolitikus aktivitása több mint 2000-szeresen meghaladta az eredeti oldatét. A fenti módon az Aspergillus aryzae kultúrából kapott és elválasztott nyers proteáz-elegy háromfajta proteázt tartalmazott. Ezek a proteázok különböző specifikusságot mutatnak különböző anyagokkal szemben, amint ez az 1. A, 1. B, és 1. C ábrákból látható. Ezeken az ábrákon : az 1. A ábra a zselatináz-akti vitást mutatja, a Britton—Robinson tompítóoldattal készített 5%-os zselatinoldat viszonylagos viszkozitásának a megfelelő pH-értéken, 37 C°-on 5 percig tartó emésztés után mutatkozó csökkenése alapján; az 1. B ábra a hemoglobináz-aktivitást mutatja, a 2%-os karbamidoldattal denaturált hemoglobin 37 C°-on történő 10 perces inkubáció során való hidrolízise alapján; a proteázaktivitás mértékeként a triklórecetsavas szüredék optikai sűrűségének növekedése szolgált; az 1. C ábrán a kazeináz-aktivitás látható, a Britton—Robinson tompítóoldattal készített 1,5%-os kazein 37 C°-on történő 30 perces inkubáció során mutatott hidrolízisének sebessége alapján; a proteáz-aktivitás nyertekéként •5 a triklórecetsavas szüredék optikai sűrűségének megnövekedése szolgált. A zselatin emésztése során tapasztalt széles pH-raaximum, annak lehetőségére mutatott, hogy a rendszerben egynél több enzim van je-10 lenv A pH-értéknek a kazein hidrolízis^sebességére való hatása azt mutatta, hogy legalább háromféle proteáz van jelen. Minthogy azonban a 4 és 5 közötti pH-értéken oldhatatlan kazein nem bizonyult tökéletes kísérleti anyag-15 nak, a 3 pH-érték körüli optimumot mutató proteáz jelenlétét tanúsító adatok félrevezetők is lehettek. Ha fehérjeként denaturált hemoglobint használtunk, a pH-aktivitás görbe nagymértékben eltért a kazeinnel és zselatinnal ka-20 pott görbétől. Ez mindenesetre azt mutatja, hogy többfajta enzim játszik szerepet e fehérje emésztésében. A proteolitikus enzimek viszonylag bomlékony anyagok, amelyek kedvezőtlen körülmé-25 nyék között denaturálódásra és inaktíválódásra hajlamosak. Ezért ajánlatos a proteolitikus en^ zim-elegyek stabilitási határait, különösen a pH-érték tekintetében, előzetesen felderíteni, hogy előre tudhassuk, hogy milyen feltételek 30. mellett, a reakciókörülmények milyen széles határai között dolgozhatunk. Az Aspergillus oryzae kultúrája által termelt proteolitikus enzimek szobahőmérsékleten a 4,0 és 6,5 közötti pH*-tartományban mutatkoztak stabilaknak; e 35 pH-tartomány egyik vagy mindkét határán túleső pH-értékeknél már irreverzibilis bomlást szenvedhetnek. Az irreverzibilis bomlás bekövetkezését oly módon próbáltuk ki, hogy az enzimeket különböző pH-értéknek tettük ki meg-40 határozott időre és azután mértük az aktivitásukat oly pH-értéken, amelyen az illető enzimek stabiloknak bizonyultak. A különböző jelenlevő proteázok mennyiségét oly módon határoztuk meg, hogy tanulmá-45 nyoztuk a pH-érték hatását az enzimek inaktíválódására. Az egyes enzimek százalékos hozzájárulását a teljes enzim-elegy által 6,0 pH-értéken mutatott proteolitikus aktivitáshoz kazein kísérleti anyagként való alkalmazásával 50 határoztuk meg. Az egyes tisztított alkotórészek tulajdonságainak tanulmányozása után elsősorban a 3,0 és 9,0 pH-értéknél kapott aktivitás-értékek korrelációját állapítottuk .'meg. Ezeket az eredményeket az alábbi I. táblázat-55 ban foglaltuk össze: I. táblázat »„- ,„..„_,._ l P r °- n P r °- IH P ro " ' pH = 3,0 27^0 25,0 48,0 6S pH = 9,0 29,0 24,0 47,0 4
