151374. lajstromszámú szabadalom • Eljárás delta1-dehidro-szteroidok előállítására
151374 5 6 és az eluátum extinkcióját 242 m/i-nál megmérve és a megfelelő vakértéket levonva (a szteroidmentes papírrészből készült eluátummal kapott érték) standard görbéről leolvastuk az oldat szteroidtartalmát. Abban az esetben pedig, ha a kiindulási anyag Reichstein S vegyület volt, akkor a papír impregnálása 30% etilénglikol tartalmú metilalkohollal történt, a mobil fázis széntetraklorid és diklóretán 1:1 arányú, etilénglikollal telített elegye volt és az eljárás a továbbiakban nem tért el a fent ismertetettől. Ebben a rendszerben a Reichstein-féle S vegyület 0.9, a zF-dehidro Reichstem S vegyület 0.72 körüli R/ értékkel fut. Azokban a kísérletekben, ahol a termelt A1--dehidro-szteroidot ki óhajtottuk nyerni a fermentátumból, a keletkező dehidro-vegyület mennyiségét a 150 244 1. sz. magyar szabadalomban leírt tíoszemikarbazonos módszerrel határoztuk meg. Találmányunk eljárás /(i-dehidro-szteroidok előállítására mikrobiológiai átalakítással oly módon, hogy az átalakítást Alcaligenes faecalis K9—2 jelű mikroorganizmussal végezzük és a keletkezett z^-dehidro-észteroidot önmagukban ismert módszerekkel elkülönítjük. A mikrobiológiai átalakítást peptont, húskivonatot és sörélesztő-kivonatot vagy peptont, és aszparagint tartalmazó táptalajon végezzük 28 C° körüli hőmérsékleten. Átalakítandó szubsztrátumként különféle szteroidokat, így pl. 17--metil-tesztoszteront, Reichstein-féle S-vegyületet stb., alkalmazhatunk. Eljárásunkat az alábbi példák szemléltetik: 1. példa: K9—2 törzs burgonyás agart tartalmazó Roux palackban nőtt, kétnapos tenyészetét 100 ml teril vízzel lemostuk. Az így kapott szuszpenzió 50 ml-ével beoltottunk 5 liter SA5—G 0. 4. 8. 12. .16. óra 3. példa: A 2. példában leírt módon eljárva és a tenyészethez ,d4 -androsztendiont, progeszteront, ül. dezoxikortikosztercnt adagolva, jó termeléssel keletkezik /F^-androsztadiendion, /P-dehidroprogeszteron, illetve /Ji-dehidrodezoxikortikoszteron. 4. példa: Az 1. példában leírt módon tenyésztettük a mikroorganizmust, de 3A5—G jelű táptalaj jelű táptalajt 10 literes üvegfermentoirban, sterilen. A fermentort 28 C°-os vízfürdőbe, percenként 3'00-as fordulatszámmal kevertettük és percenként 5 liter levegőt engedtünk át a tenyészeten. 16 órás tenyésztés után 1 g metiltesztoszteront adagoltunk a tenyészethez. 50 ml acetonban feloldva. A fermentorból 6 órás időközökben 100—100 ml mintát vettünk, a mintákat 3X1/3 térfogatnyi diklóretánnal extraháltuk, az extraktumokat megszárítottuk, bepároltuk és a bepárlási maradékot cseppentettük fel a kvantitatív papírkromatografiás analízishez. A mérések alapján a fermentátumban a zl^-dehidro-metiltesztoszteron tartalom a következőképpen alakult: 6 óra 425 mg 12 óra 640 mg 18 óra 1000 mg A mikroorganizmus tehát a 17-metiltesztoszteront kvantitative átalakította a /^-dehidroszármazékká. 2. példa: Az 1. példában leírt módon tenyésztettük a mikroorganizmust. 16 órás tenyésztés után 500 ml-es steril Erlenmeyer-lombikokban 100—100 ml-ként szétmértük a tenyészetet. Öt lombikhoz 20—20 mg 17-metiltesztoszteront 1—1 ml acetonban feloldva, másik öt lombikhoz 40—40 mg metiltesztoszteront 2—2 ml acetonban feloldva adagoltunk. A lombikokat ezután 28 C°-on tartott rázószobában, 2 cm-es kitérésű, körpályán mozgó, percenkén- 200-as fordulatszámú síkrázó asztalon inkubáltuk és a lombikok metiltesztosztero'n, ill. /f'-dehidro-metiltesztoszteron tartalmát az 1. példában leírt módon határoztuk meg az alábbi időpontokban: helyett PA jelű táptalajt alkalmaztunk. 16 órás tenyésztés után, 100—100 ml tenyészetet sterilen szétmértünk 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba. 5 lombikhoz 20—20 mg Reichstein-féle S-vegyületet adagoltunk és az adagolás utáni 12., ' 24., 36. és 48. órában papírkromatográfiás analízissel határoztuk meg a tenyészetek /)'-dehidro Reichstein S-vegyület tartalmát. Az eredmények a következők voltak: 12 óra: 3.2 mg/100 ml tenyészet, 24 óra: 12.2 mg/100 ml tenyészet, 10 15 20 25 30 sjd 40 mei AU mel /F-i 55 60 20 mg-os bemérésből: 20 mg 0,4 mg 0 mg 0 mg 0 mg metiltesztoszteron/100 ml, 1,40 mg 21,1 mg 21,7 mg 21,2 mg 20 mg /l'-dehidrometütesztoszteron/lOO ml 40 mg-os bemérésből: 38,8 mg 23,8 mg 13,7 mg 9,0 mg 6,0 mg metiltesztoszteron/100 ml, 4,4 mg 24,5 mg 29,2 mg 38,2 mg 42,2 mg /F-dehidrometiltesztoszteran/lOO ml 3
