151374. lajstromszámú szabadalom • Eljárás delta1-dehidro-szteroidok előállítására
3 151374 4 Azotomonas speciesek, amerikai szabadalom: 2 992 973, Azotobacter speciesek, Mycobacterium speciesek, amerikai szabadalom: 2 905 592, Pseudomonas speciesek, amerikai szabadalom: 3 037 915, Serratia speciesek, Bact. havaniensis, amerikai szabadalom: 3 037 914, Bact. mycoides, amerikai szabadalom: 3 037 913, Streptomyces speciesek, amerikai szabadalom: 3 039 937. Kutatásaink során azt találtuk, hogy egy általunk talajmintából izolált K9—2 jelzéssel ellátott mikroorganizmus, amelyet az OKI-ben 1963. III. 1-én 21. sz. alatt letétbe helyeztünk, képes a /1J-es kettőskötés kialakítására különféle szteránvázas vegyületekben. Az ismert ilyen képességű mikroorganizmusokkal szemben kitűnik azonban azzal a sajátosságával, hogy a 17-metiltesztoszteront és a 17-alfa, 21--dioxiprogeszteront (Reiehstein-féle S-vegyületet) különösen jó hatásfokkal alakítja át a megfelelő /^-dehidro származékká. A K9—2 jelű mikroorganizmus 2—2,5 /.i hosszú, kb. 0,8 t1 vastag, legömbölyített végű pálcika, amely gyakran páros alakban észlelhető. Élénken mozgó, elektronmikroszkópos felvételen bipoláris, lophotrich csillós organizmus, amelynek a csillói a baktériumtestnél hosszabbak és gyengén hullámosak. Fáziskontraszt mikroszkóppal vizsgálva, a sejtekben bipolárisan, többé vagy kevésbe kifejezett fénytörést mutató, szemcsék észlelhetők. Gram szerint negatívan festődik. Burgonyás agáron, 7,2-es pH-jú peptonos agáron egyenletesen, jól nő, aszparaginos és Sabouraud agáron kevésbé jól, illetve rosszul nő. Szorbitos agáron nem növekszik. Burgonyaszeleten öt nap alatt kinő. Zselatinos táptalajon jól nő, nem folyósít. Peptonvizet enyhén zavarosítja, dús üledéket képez, de felületi hártyát nem alkot. 6% alkoholt tartalmazó bouillonon kinő. Az alkoholt nem oxidálja ecetsavvá. 24 és 28 C°-on egyformán jól szaporodik, 37 C°-on gyengén szaporodik. Indolt nem képez, nitrátot nem redukál, a lakmusztejet gyengén lúgosítja, de nem alvasztja. Növekedéséhez glükózt nem igényel, szacharóz-, mannit-, glükóz-, maltóztartalmú táptalajon nő, laktóz jelenlétében azonban lassabban szaporodik. Ezekből a cukrokból 8 hét alatt sem termel savat. Burgonyás agárlemezen csipkézett szélű, többnyire sugarasan rovátkolt fényes telepeket képez. A telep széle áttetsző, közepe kiemelkedik, oldalnézetben enyhén kúp alakúak. Színük szürkésdrapp, centrumuk tömöttebb, átnézetben a sötétebb centrumot világosabb udvar veszi körül. Zselatinos táptalajon világosdrapp, konkáv, fényes, áttetsző, kerek telepeket képez. A vizsgált tulajdonságai alapján az organizmus a Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 6. kiadás 412. oldalán leírtak szerint főbb vonásaiban megegyezik az Alcaligenes faecalis-szal. Az eltérések a következők: a megkövetelt adatok szerint A. faecalis növekedé-5 séhez az optimális hőmérséklet 37 C°, perilrich csillós és nincs jellegzetes szaga. A K9—2 törzs ezzel szemben 24 és 28 C°-on jobban nő, mint 37 C°-on, bipoláris lophotrich csillós és tenyészetének halszaga van. V. B. D. Sker-10 man: A Guide to the Identification of the Genera of Bacteria (Williams '& Wilkins Co., Baltimore 2, Maryland, 1959.) c. művében az első két eltérést megengedhetőnek tartja, a szagról nem tesz említést. Ezek alapján a 15 K9—2 törzs Alcaligenes faecalisként identifikálható. A mikroorganizmus a legkülönfélébb, szerves anyagokat tartalmazó táptalajokon tenyészthető. Mi előnyösen tenyésztettük SA 5—G jelű, 20 illetve PA jelű táptalajon, melyek összetétele a következő: SA 5—G jelű táptalaj: 250 g pepton, 25 50 g húskivonat, 9 ml sörélesztő kivonat, csapvízzel, pH 6,5—7, feltöltve 5 litem PA jelű táptalaj: 30 75 g pepton. 25 g aszparagin, zel, pH 7. feltöltve 5 literre csanvíz-A törzset burgonyás agáros táptalajon tar-3f> tottuk fent hetenkénti átoltásokkal. Az organizmus tenyészetéhez az átalakítandó szteroidot szerves oldószerben, pl. acetonban vagy alkoholban oldva adagoltuk. A szteroidok átalakítását kvalitatív és kvantitatív papír''.() kromatográf iával követtük. Utóbbi esetben úgy járunk el, hogy a fermentátumot megfelelő polaritásű organikus oldószerrel, pl. dikl őre tannal extraháltuk. Az extraktum ot bepároltuk, a bepárlási maradékot pl. aceton-45 kloroform elegyében feloldottuk, úgyhogy a koncentrátum szteroidtartalma 4 mg/ml körül legyen. Ebből az oldatból cseppentettünk fel 50—100 rt-t, előzetesen túlfolyó kromatogram alakjában etilalkohollal mosott Macherey— i;0 Nagel 214 jelű papírra, amelyet a felcseppentés előtt aszerint impregnáltunk, hogy milyen polaritásű volt a vizsgált szteroidkeverék. így pl. ha a kiindulási anyag zl4-androszténdion. vagy 17-metiltesztoszteron volt, akkor a papírt 15 30% propilénglikolt tartalmazó metilalkohollai impregnáltuk és a mobil fázis széntetraklorid és metii-ciklohexán 1:1 arányú, propilénglikollal telített elegye volt. Ebben a rendszerben a :14 -androszténdion 0,68, a ,4 T > 4 -androsztadienfií) dión 0,41, a 17-metiltesztoszteron 0,20 és a -l, -dehidro-17-metiltesztoszteron 040 körüli Kiértekkel futott. A papírkromatogramon a szteroidfoltokat ultraibolya kontakt fotózással kimutatva, a foltot tartalmazó papírrészt kivág-65 tuk, 10 ml pro ana.l. absz. alkohollal eluáltuk
