151218. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új antibiotikumok előállítására
151218 15 16 gélen kromatografáljuk, az 1. példában leírthoz hasonló módon. 3,5 mg nyers kristályos A-verrukarint kapunk (amely még tartalmaz B-verrukarint is). 5. példa: A-verrukarin és B-verrukarin előállítása és kimutatása Az S 118 törzset az 1. példában leírthoz hasonló körülmények között inkubáltatjuk. Az extrahálás és a további feldolgozás 780 ml fermentációs léből kiindulva, pontosan az 1. példában leírt módon történik. Ily módon 44 mg barnára . színezett nyers etilacetátos kivonatmaradékot kapunk, amely az 1. példában leírthoz hasonló módon kivitelezett vékony rétegű kromatografálás során két foltot mutat, amelyek futtatási távolsága az A-verrukarinnak ill. B-verrukarinnak felel meg. 6. példa: Nyers A-verrukarin, B-verrukarin és A-roridin előállítása és elkülönítése Az S 750 törzset 7 literes fermentorban (a New Brunswick Co., New Brunswick, USA cég FS 3'07 típus-jelű gyártmánya) 5 liter tápoldattal (az 1. példában leírt Richard-féle tápoldat) szellőzés és keverés (300 fordulat/perc) mellett 27° hőmérsékleten tenyésztjük. A micélium kiszűrése után 4,1 liter világossárga fermentációs levet 5—5 liter etilacetáttal háromszor extrahálunk, az egyesített kivonatot 1 liter vízzel egyszer mossuk, majd vákuumban 500 ml térfogatra besűrítjük. Az így kapott 0° hőmérsékleten 100—100 ml 2 n nátriumhidroxidoldattal háromszor, majd 100—100 ml vízzel háromszor mossuk, azután vákuum alatt bepároljuk. 6'80 mg sárgás színű nyers terméket kapunk. Ezt további tisztítás végett 30 g szilikagélen kromatografáljuk. Eluálásra frakcióként 60 ml oldószert használunk. Az 1—10. frakcióból (benzollal és kloroformmal eluálva) 318 mg olajat kapunk (ezt kiselejtezzük). A 11. frakcióból (81 mg, eluálva 99:1 kloroform-metanol eleggyel) éterből történő átkristályosítás után 34 mg kristályos A-verrukarint kapunk, amely az 1. példában leírt módon elkészített vékony rétegű kromatogramon egységesnek mutatkozik. Az anyalúgból éterrel kristályosítva még 11 mg elegy-terméket kapunk, amely A-verrukarinból és A-roridinből áll. A 12—16. frakció (152 mg, eluálva 99:1 kloroform-metanol eleggyel) éterből kristályosítva 61 mg kristály elegyet kapunk, amely vékony rétegű kromatográfiával vizsgálva főként A-verrukarinból állónak mutatkozik, de B-verrukarint és A-roridint is tartalmaz. A 11—16. frakció egyesített anyalúgjaiból kapott termék (125 mg) még kb. 30 mg A-verrukarint és 30 mg A-roridint tartalmaz. A 17—23. frakció (eluálva 99:1, 98:2 és 1:1 kloroform-metanol eleggyel) 79 mg amorf anyagot ad (kiselejtezve). 5 7. példa: A-roridin előállítása és elkülönítése A Myrothecium roridum S 973 törzset 5 liter 10 tápoldatban (összetétel: 20 g glükóz puriss., Ph. H. V., 2,0 g malátakivonat (Schweiz. Ferment AG.), 2,0 g élesztőkivonat (Difco), 2,0 g pepton (Cudahay), 2,0 g primer káliumfoszfát, 2,0 g magnéziumszulfát i(«7H20), 0,2 g vas-15 szulfát (-7H2 0) New Brunswick FS 307 típusú fermentorban szellőztetés (5 liter/perc) és keverés (300 fordulat/perc) mellett tenyésztjük. A micélium kiszűrése után a sárga színű tiszta oldatot, amelynek pH-értéke 6, háromszor ext-20 raháljuk 5^5 liter etilacetáttal. Az egyesített kivonatot 1 liter vízzel egyszer mossuk, majd 700 ml térfogatra bepároljuk vákuum alatt, azután pedig 0° hőmérsékleten 80—80 ml 2 n nátriumhidroxidoldattal háromszor és 80—80 25 ml vízzel kétszer mossuk és bepároljuk. 5,7 g sárga színű nyers terméket kapunk, amely aceton és éter elegyéből kristályosítva 105 mg kristályos A-roridint ad; e termék olvadáspontja 190—195°, az anyag vékony ré-30 tegű kromatográfiával egységesnek mutatkozik. Az anyalúgból kapott terméket (5,6 g) 250 g szilikagélen kromatorafáljuk. Az eluálásra frakcióként 250 ml oldószert használunk. Az 1—10. frakció (eluálva 35 benzollal, kloroformmal és 99,5 : 0,5 kloroform-metanol eleggyel) 2,32 g olajos terméket ad (kiselejtezzük). A 11—21. frakció {2,45 g, eluálva 99:1 kloroform-metanol eleggyel) kloroform és metanol 97:3 arányú elegyéből kristályosítva 40 1,2 g nyers kristályos A-roridint ad, amely vékony rétegű kromatográfiával vizsgálva még némi A-verrukarin és egy nem azonosított „A" anyag jelenlétét mutatja. Aceton-éter-petroléter elegyéből kristályosítva 428 mg kris-45 tályos A-roridint (op. 191—496°), 166 mg kristályos A-roridint, amely még nyomokban „A" anyagot is tartalmaz, valamint 218 mg A-roridinből és „A" anyagból (1:1 arányban) álló kristályelegyet kapunk. 50 Az A-roridint aceton-éter elegyből történő átkristályosítás után 191—196° vagy 198—204° olvadáspontú színtelen prizmák alakjában kapjuk. 55 8. példa: Nyers A-verrukarin, B-verrukarin és A-roridin előállítása és elkülönítése 60 Az S 1135 törzset (az S 973 törzs szaltánsát) a 7. példában leírttal egyező tápoldatban egy 50 literes fermentorban (Ultramix-rendszer, FU 005 típus, Heh. Bertrams AG., Basel, Svájc) keverés (1450 fordulat/perc) és szellőzés (50 65 liter/perc) közben, 0,4 atm. túlnyomás alatt 8
