151218. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új antibiotikumok előállítására
17 151218 18 tenyésztjük. Ezután 50 liter fermentációs levet kovaföld (Cellite) szűrési segédanyag hozzáadásával leszűrünk, a kapott sárga színű tiszta szüredéket 40—40 liter etilacetáttal hatszor extraháljuk és az egyesített kivonatot vízzel mossuk. A mieélium és a kovaföld keverékét víz hozzáadása után homogenizáljuk és 10—10 liter etilacetáttal háromszor kikeverjük. A szűrés és vízzel való mosás után kapott kivonatot egyesítjük a fermentációs lé szüredékének etilacetátos kivonatával és vákuumban kb. S liter térfogatra bepároljuk. A bepároit kivonatot 1 liter 2 n nátriumhidroxidoldattal, majd kétszer 0,5—0,Í5 liter 2 n nátriumhidroxidoldattal és vízzel mossuk, azután vákuum alatt szárazra bepároljuk. A kapott 206 g maradékból éter hozzáadása után 78 g nyers kristályosított terméket nyerünk, amely az 1. példában leírthoz hasonló módon végzett vékony rétegű kromatograíálással vizsgálva túlnyomórészt A-roridinből állónak mutatkozik, melléktermékként azonban C-roridint, A-verrukarint és B-verrukarint is tartalmaz. Első anyalúg maradékként 128,5 g anyag marad vissza. A 78 g nyers kristályosított terméket metanollal felvesszük és az oldatot leszűrjük. A metanolban oldhatatlan 2,5 g anyag oly kristályosított termékből áll, amelyben túlnyomórészt C-roridin van feldúsulva, de amely még szenynyezésként A-verrukarint is tartalmaz. A metanolban oldódó részt bepároljuk és a kapott maradékot metanol és éter elegyéből frakcionálva átkristályosítjuk. Ily módon 1. a 33,9 g tiszta kristályos A-roridint, 2. 26,0 g kristályos A-roridint, amely még némi C-roridint, A-verrukarint és „A" anyagot is tartalmaz, valamint 3. 15,6 mg második anyalúg-maradékot kapunk. Ez utóbbit egyesítjük a fent említett első anyalúg-maradékkal (144 g) és 520 ml 3 : 1 kloroform-benzol elegyben oldjuk. 260 ml oldatot (amely 72 g anyalúg-maradéknak felel meg), 3,77 kg szilikagélen az 1. példában leírthoz hasonló módon kromatografálunk. A 95 : 5 arányú kloroform-metanol eleggyel eluált frakciókból éterrel történő kristályosítás útján 1,2 g tiszta kristályos A-verrukarint kapunk. 9. példa: A-roridin, B-roridin, C-roridin, A-verrukarin és C-verrukarin előállítása és elválasztása A Myrothecium roridum S 1135 törzset egy 10 literes fermentorban (Ultramix-rendszer, FU 001 típus, Heh. Bertrams A. G., Basel, Svájc) percenként 10 liter levegő befúvatásával, 0,4 atm túlnyomás alatt, 27 C° hőmérsékleten az alábbi összetételű tápoldatban inkubáltatjuk: 30,0 g glükóz puriss., Ph. H. V, 1,0 g élesztőkivonat (Difco), 4,0 g ammóniumnitrát, 2,72 g primer káliumfoszfát, 1,23 g magnéziumszulfát (•7H2OV 0,028 g vas(II)-szulfát (-7H°0), 0,003 g cinkszulfát (-7H2 0), 10 liter fermentációs levet azután kovaföld (Cellite) rétegen át leszűrünk és a sárga színű tiszta szüredéket 10—10 liter etilacetáttal háromszor extraháljuk. A kivonatot 1 liter vízzel mossuk, majd vákuumban teljesen bepároljuk. A maradékot 1 liter kloroformban oldjuk, az oldatot 100—100 ml 2 n 5 nátriumhidroxidoldattal háromszor, majd 10O— 100 ml vízzel négyszer mossuk. A mosott kloroformos oldatot bepárolva 12,0 g sárga színű nyers terméket kapunk, amelyet további szétválasztás céljából 2501 g szilikagélen kromatog-10 rafálunk. I. kromatografálás: Frakciónként 500 ml oldószerrel eluálunk. Az 1. és 2. frakció (benzollal eluálva) 7,88 g olajat tartalmaz (kiselejtezve). A 31—6. frakció (482 mg, kloroformmal eluálva" 15 éterből vagy petroléterből kristályosítva 23 mg kristályos B-roridint ad, amely 140—147°-on olvad és vékony rétegű kromatograiálással egységesnek mutatkozik. A 7. és 8. frakció (eluálva 99:1 kloroform-metanol eleggyel) 101 mg amorf 20 terméket ad (kiselejtezve). A 9. és 10. frakció (1,48 g, eluálva 99:1 kloroform-metanol elegygyel) éterből kristályosítva 646 mg kristályos terméket ad, op. 122—143°. Aceton és éter elegyéből átkristályosítva 400 mg kristályos 25 terméket kapunk, amely 130—138°-on olvad és főként A-roridinből, továbbá A-verrukarmból és C-roridinből áll. E kristályos termék további szétválasztása a II. kromatografálás során történik (lásd alább). 30 A 11. frakció (305 mg, eluálva 99:1 kloroform-metanol eleggyel) éterből kristályosítva 106 mg kristályos A-roridint ad, amely nyomokban kísérőanyagokat is tartalmaz. E termék további tisztítása a III. kromatografálás, 35 az anyalúgoké pedig a II. kromatografálás során történik. A 12—20. frakció (eluálva 99:1, 98:2 és 1:1 kloroform-metanol eleggyel) nem ad kristályos terméket. A 12. és 13. frakció (330 mg) további tisztítása a II. kromatogra-40 falás során történik. II. kromatografálás: A 9., 10. és 11. frakció anyalúg-maradékait, valamint a 12. és 13. frakciót egyesítjük és az így kapott összesen 1,39 g anyagot megosztásos kromatográfiának vetjük 45 alá, 700 g 1 : 1 arányú kovaföld-víz keverékei alkalmazva stacioner fázisként, míg mozgó fázisként az alább megadott, vízzel telített oldószereket alkalmazzuk, frakciónként 200 ml mennyiségben. Az 1—19. frakció (eluálva ben-50 zollal és 95:5 arányú benzol-kloroform elegygyei) 269 g amorf anyagot ad (kiselejtezve). A 20—25. frakció (91 mg, eluálva 95:5 benzolkloroform eleggyel) étefből kristályosítva 13 mg tiszta kristályos B-verrukarint ad. A 55 26—30. frakcióból (eluálva 95:5 benzol-kloroform eleggyel) 62 mg amorf anyagot kapunk (kiselejtezve). A 31—38. frakció (130 mg, eluálva 95:5 benzol-kloroform eleggyel) éterből kristályosítva 12 mg tiszta kristályos A-verru-60 karint ad. Az anyalúgokból éteres kristályosítással 20 mg tiszta kristályos C-roridint kapunk, amely 117—121°-on olvad. A 39—43. frakció (60 mg, eluálva 95:5 arányú benzolkloroform eleggyel) éterből, frakcionált kris-65 tályosítással 28 mg tiszta kristályos A-verru-9
