151019. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kobalaminok előállítására
151019 a folyamatos vagy félfolyamatos tenyészet, amely adott körülmények között dúsan fejlődik, bizonyos idő múlva (6—12 nap) gyengülni kezd és fokozatosan mind alacsonyabb lesz a baktériumszám, ill. a termelt B12-vitamin menynyisége. d) A kolloidok védőhatást gyakorolnak a baktériumszuszpenzió stabilitására és megnehezítik a baktériumtömegnek a tápoldatból való kinyerését, történjék ez a művelet akár ülepítéssel, akár centrifugálásisal, akár szűréssel (utóbbi esetben a kolloid természetű anyagok eltömik a szűrő pórusait). Azt találtuk, hogy a fenti hátrányok kiküszöbölésével állíthatunk elő kobalaminokat propinobaktériumok fermentációja útján, ha a fermentációhoz kolloidszegény táptalajt alkalmazunk, amely 0,25—0,5% kukoricalekvár szárazanyagot, vagy 1% kukoricalekvár szárazanyagnak megfelelő fehérjementes kukoricalekvár extraktumot tartalmaz. A találmányunk szerint alkalmazott táptalajok nitrogénforrásként olyan anyagot tartalmaznak, amelyek krisztalloid oldatot adnak. Ilyen anyagok az ammónium-sók, az egyszerű alifás aminők, a karbamid stb. Ezek az anyagok a Propinibaktériumok nitrogénszükségletét kielégítően fedezik. A találmányunk szerinti táptalajban lényeges faktorként glükóz, anorganikus sók, nitrogéntartalmú egyszerű molekulákat tartalmazó anyagok, pantoténsav és biotin van jelen a kukoricalekváron, ill. kukoricalekvár extrakton kívül. A táj talajhoz adagolt kukoricalekvár-extraktum tudomásunk szerint új anyag, amelyet az irodalomban még nem írtak le. A kukoricalekvár-kivonat előállítása történhet oly módon, hogy kukoricalekvárt vízben oldódó szerves oldószerrel kezelünk, pl. alkoholokkal (metanol, etanol) vagy acetonnal, majd a szűrt oldószerelegynől az oldószert lepároljuk, és a vizes maradékot használjuk fel a táptalajban. Előnyösen alkalmazható extrahálószer az 50%-os metanol vagy 35—40%-os aceton. A találmányunk szerinti eljárás további foganatosítási módja szerint a kukoricalekvár extraktumot úgy állítjuk elő, hogy a kukoricalekvárt vízzel hígítjuk, majd a fehérje anyagokat az oldatból kisózzuk. Hígításhoz előnyösen a kiindulási kukoricalekvárral mintegy megegyező térfogatú vizet használunk. Kisózáshoz célszerűen olyan anyagokat alkalmazunk, amelyek a fermentáció szempontjából biológiailag kívánatosak, tehát amelyeket a táptalajhoz mindenképpen hozzá kellene adnunk. így előnyös ammóniumsók, pl. ammóniumszulíát alkalmazása. Ebben az esetben tehát a hígított kukoricalekvárhoz ammóniumszulfátot adva az abban levő fehérjéket kicsapjuk, majd az oldatot megszűrj ük és az ily módon nyert kolloidmentes, ammóniumszulfátot már tartalmazó oldatot használjuk fel a táptalaj készítéséhez. A találmányunk szerinti táptalaj egy előnyös összetétele a kukoricalekváron, ill. extrakton kívül pl. az alábbi: 1—3% glukóz vagy invertcukor, 0,26-^0,75% ammóníumszulfát, 0,1—4),2% KCl, 0,1—0,5% NaCl, 0,1—0,3% Na2HPO.— —7 H2 0, 0,1—0,2%, MgS0 4 -7 H 2 0, 0,1—2% 5 CaCOj, 10—40 mg/1 FeS04 -7 ILO, 5—10 mg/l Co(N03) 2 • 5 H2 0, 0—40 mg/l Ca-pantothenát, 0—1 mg/l biotin. A táptalaj pH-értékét előnyösen 7,2—7,3-ra állítjuk be. A szokásos módon dolgozva olyan ferment! evet nyerünk Pro-10 pionibaktérium oltóanyaggal, amely. a baktériumtörzstől függően 3—6 ."g/ml Bi2 -vitamint tartalmaz és 2—4% ammóniumhidroxid-oldattal (26%-os) kezelve jól ülepedő, jól szűrődő csapadékot ad, amely a baktériumtömeget raagá-15 ban foglalja. Különösen alkalmas a találmányunk szerinti táptalaj az olyan propionibaktériumtörzsek tenyésztésére, amelyek más táptalajokon tenyésztve nehezen választhatók el a tápfolyadéktól. 20 Ilyen törzs a P. petersonii vagy a PBs—77 jelzésű P. shermanii törzs, amely utóbbi Bio mellett B12-vitamin-monokarbonsavat is termei. Ez utóbbi törzs fermentlevének szűrése, ill. feldolgozása mindeddig nehézségbe ütközött. 25 Igen előnyösen alkalmazható nevezett táptalaj félfolyamatos vagy folyamatos Propionibaktérium-tenyésztésnél is, amikor is a prekurzor (5,6-dimetilbenzimidazol) nélkül táptalajon heteken át tartósan 9—12 M/ml körüli B12 -vita-30 min szintet (coli-érték) lehet fenntartani. A tenyészet semmi hajlamot nem mutat a kimerülésre, amint ezt a kukoricalekvárban gazdagabb táptalajokban észleljük, amelyek kezdetben magas, majd a második héttől kezdve foko-35 zatosan csökkenő B12 -vitamin-termelést mutatnak. Eljárásunk további részleteit a példák ismertetik. 4ü Példák: 1. Elkészítjük a következő összetételű táptalajt: Glukóz- 2%, Ammóníumszulfát: 0.4%, KCl':0,l%, NaH2 P0 4 :7H 2 O, 0,lo/ 0 MgSQ 4 -7H,0: :0,1%, CaC3 0 0,2%, kukoricalekvár-szárazanyag: 45 0,25%, FeSO'4-7 H2 0: 40 Mg/ml, Co(NO s ) 2 -6 H 2 0: 5 yug/ml, Ca-pantothenát: 25 /'g/ml. A pH-értéket 7—7,2-re állítjuk és 120 C°-on 20 percig sterilizálunk. E táptalaj 500 ml-ét üveglombikban beoltjuk 50 10 ml azonos táptalajon készült 5 napos Propionibacterium shermanii oltóanyaggal és 25— 26 C°-on tartjuk 8 napig. Az ötödik napon 2 fd/ráí savban oldott 5,6-dímetilbenzimidazolt adunk a tenyészethez. A 8. napon a tenyészet-55 ben 5,4 Mg/ml B12 -vitamin mutatható ki. A tenyészethez 2% technikai ammóniumhidroxidoldatot adva, összekeverés után pelyhes csapadék keletkezik, amely 6 óra alatt a folyadék térfogatának 23%-ra ülepszik le, a felülúszó 60 folyadék pedig teljesen éles, átlátszó. A leülepedet csapadék könnyen szűrhető. A leszűrt csapadékot 0,2%-os NH4 OH-oldattal addig mossuk, míg a lefolyó oldat színtelen lesz. 2. Az 1. példában leírt táptalajt 3% Propioni-65 bacterium shermanii Pbs—77 jelzésű törzzsel 2
