151003. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív, vízoldható sejtfalpoliszaharidok előállítására mikroorganizmusokból

151003 3 4 és mt.: Helv. chim. Acta, 23. 375, 1940.; Bourne és mt.: J. Chem. Soc. 2694, I960.), etiléndiamint (Shakman ás mt.: Biophys. Biochim. Acta, 24. 203, 1957.), vagy felületaktív dezoxikolátot (US Szabadalom:: 2 892 755, 1956.) használnak). A felsorolt irodalmi adatok alapján azonban logikusan adódik az a következtetés, hogy e kivonási módszerek bármelyike csak egy-egy meghatározott sejtfalszerkezetű mikroorganizmus poliszaharidjának kivonására alkalmazható eredményesen. Hasonló a helyzet Westphal és mt. fenolos módszerénél (Z. Naturforschung, 7B. 148, 1952.), amely alkalmas ugyan Gram negatív baktériumokból pirogén hatású lipopoliszaharidok előállítására, de előnyösen csak Salmonelláknál és E. coli esetében alkalmazható. A felsorolt különleges és körülhatárolt felhasználási területre korlátozott módszerek mellett mind elvi, mind pedig ipari szempontból jelentősek azok a próbálkozások, amelyek bármilyen mikroorganizmus biológiailag aktív poliszaharidjainak kivonására egyaránt alkalmas eljárás kidolgozását tűzték ki célul. Az új eljárások kidolgozását az is szükségessé tette, hogy a gombák micéliuma az előzőekben ismertetett eljárásokkal nem dolgozható fel. E követelmény biztosítására egyes eljárások a mikroorganizmus lúgos közegben végzett extrák ció ját és esetleg magas hőmérsékleten végzett feltárás alkalmazását találták célravezetőnek (Barclay és mt.: J. Chem. Soc, 1501, 1954.; Haworth és mt.: J. Chem. Soc, 833, 941. és 1211, 1948.; Cronshaw és mt.: Biophys. Biochim. Acta, 27. 103. 1958.). Ezek az eljárások azonban azzal a veszéllyel jártak, hogy olyan átalakulások következnek be a szénhidrát szerkezetében, melyek a biológiailag aktív anyag kinyerhetőségét számottevően lerontják. További nehézséget okozott az is, hogy lúgos közegben a sejt legtöbb komponense, így igen sok fehérje a kivonatba jut, s ezek eltávolítása bonyolult frakcionálási tesz szükségessé. A mikroorganizmus sejtmentes kivonatából a fehérjék eltávolítását egyesek ammóniumszulfáttal, triklórecetsavval, triklórtrifluoretánnal vagy etilalkohollal (Davies és mt.: Biochem. J., 60. 290, 1955.; Gesser és mt.: Trans. N. Y. Acad. Sei., 18. 701, 1956.) végezték, de alkalmazták az ebben a fázisban még igen költséges és hosszadalmas tripszines emésztést is. Ugyancsak a fehérjék eltávolítását és egyben a szénhidrátot magábanfoglaló lipoprotein komplex megbontását célozta a különböző detergensek alkalmazása is. így egyes eljárások vízzel nem, vagy csak részben elegyedő oldószer-párokat szobahőmérsékleten (Heidelberger és mt.: J. Exp. Med., 64. 559, 1936.; Miles és mt: Brit. J. Exp. Pathol., 20: 83, 1939.), mások karbamidot, guanidint (Magyar szabadalom: 147 794, 1959.), vagy fenolt (Westphal és mt.: Z. Naturforschung 7B. 148, 1952.) 50—100 C° közötti hőmérsékleten használtak. A biológiailag aktív poliszaharid tisztán és homogén formában való előállítását azonban egyik eljárás sem oldotta meg, nem is szólva arról, hogy ezen eljárások egyes alkalmas kombinációinak ipari kivitelezhetősége és gazdaságossága a nagy anyagköltség és a hosszadalmas és bonyolult technológia miatt igen kétséges. Vizsgálataink során különféle, elsősorban ipari célokat szolgáló fermentációkból származó mikroorganizmusokból kiindulva (Acetobacter suboxidans, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces karlsbergiensis, Streptomyces nursei, Strepetomyces fradiae, Aspergillus niger, Absidia orchidis) tanulmányoztuk a biológiailag aktív (clearing-hatású) poliszaharidok előállítását figyelemmel az előbbiekben vázolt megoldásra váró három feladatra. Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy a poliszaharid oldatba vitele során alacsony koncentrációban alkalmazott sóknak a fehérjék esetében is ismert oldékonyság- és stabilitísfokozó hatása a mikroorganizmus eredetű poliszaharidoknál is érvényesül. E felismerés legelőnyösebben a sejtek lúgos feltárásakor alkalmazható, amikor is sók hozzáadása az aktív poliszaharid kinyerését számottevően növeli. E felismerésünk alkalmazása révén elérhetővé válik a különböző mikroorganizmusok sejtfalpoliszaharidjainak — közöttük a gombákéinak is — a korábban ismert eljárásokét meghaladó hatásfokkal történő kivonása, amely viszonylag rövid idő alatt, gazdaságosan vitelezhető ki még ipari méretekben is. Azt tapasztaltuk továbbá, hogy a kivonatba jutott kísérő fehérjék nagy része viszonylag egyszerű módon — fehérjekicsapószerek hozzáadása nélkül — izoelektromos pontjukon történő hőkoagulációval eltávolítható, majd az így nyert kivonat tovább tisztítható alkáliföldfémek sóinak hozzáadásával. E sóknak már viszonylag kis mennyisége is elegendő ahhoz, hogy a g3rengén savanyú közegben kicsapják, illetve ezt követően a lúgos közegben kiváló alkáli földfém-hidroxidok pedig adszorbeálják mindazokat a kivonatban még jelenlevő nemkívánatos anyagokat (nukleotidok, zsírsavak, pigmentek, fehérjék), amelyek pl. szerves oldószeres kivonatolás alkalmazásánál az aktív poliszahariddal együtt csapódnának ki. Az alkáli földfém sók alkalmazásának további előnye, hogy a kivonat szénhidrátjainak bizonyos mértékű frakcionálását teszik lehetővé. így egyrészt bizonyos farmakológiailag hatástalan neutrális poliszaharidok az aktív poliszaharid mellől eltávolíthatók azon az alapon, hogy a bárium ion lúgos közegben a mannánnal és a glukomannánnal vízoldhatatlan komplexet képez (Acta Chem. Scand. 12. 144, 1958.), másrészt az aktív poliszaharid alkáli földfém sója alakjában már vízzel elegyedő szerves oldószerek viszonylag alacsony koncentrációnál kicsapható a kivonatból. Az alkáliföldfémek sóinak alkalmazása tehát nemcsak azt eredményezi, hogy a kivonat jelentős mértékben tisztul a kísérő szennyeződésektől, hanem elősegíti az aktív anyag elkülönítését is, valamely vízzel elegyedő szerves oldószer már olyan kis mennyiségével, mely az eddig ismert eljárások oldószer igényének jóval alatta 15 20 25 30 SS 11 r5 60 2