151003. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív, vízoldható sejtfalpoliszaharidok előállítására mikroorganizmusokból

5 van. Ez a körülmény eljárásunk ipari kivitelezhetőségét a módszer gazdaságossága folytán nagymértékben fokozza. Az alkáliföldfém sók alkalmazásának további előnyét jelenti az is, hogy megállapításunk szerint az aktív poli- 5 szaharid alkáliföldfém sójának megbontása után — tehát gyengén savanyú közegben, — már csak a vízzel elegyedő szerves oldószer magasabb, 30 tf.% feletti koncentrációinál csapódik ki, ami a poliszaharid további frakcionálására io ad új lehetőséget. A találmány szerinti eljárás harmadik fázisa annak az ismert elvnek a glikolipoproteinkomplex megbontására való újszerű érvényesítést jelenti, amely szerint az alkoholok fehérje 15 denaturáló és zsír oldó hatása a hőmérséklet növelésével és magasabb szénatomszámú alkoholok alkalmazásával fokozódik. Kísérleteinkben azt találtuk, hogy ha a különböző mikroorganizmusok lúgos, sós kivonatából a fent 2

0 leírt elvnek megfelelően vízzel elegyedő szerves oldószeres, célszerűen etilalkoholos frakciónálással nyert terméket 50—100 C° közötti hőmérsékleten 3—8 szénatomszámú alifás alkohol olyan mennyiségével kezeljük, mely a vizes 9,5 közeggel még homogén fázist képez, a nyert termékben a fehérje-nitrogén és a lipoidok mennyisége csökken, a biológiai hatás ugyanakkor fokozódik. Az aktív poliszaharid hasonló tisztítása elérhető ugyan jóval nagyobb mennyi- 30 ségű metilalkohol, vagy etilalkohol alkalmazásával is, de a clearing hatás, számottevő növekedése nélkül. Az utóbbi jelenség arra mutat, hogy ezen a magasabb hőmérsékleten a nagy alkohol koncentráció hatására a poliszaharid 35 funkciós csoportjai kémiailag módosulnak. Ebből adódik a magasabb szénatomszámú alkoholok alkalmazásának az a lényeges gazdasági előnye, hogy —• szemben az etilalkohollal, vagy a korábban detergálásra használt oldószer- 40 párokkal — már kis, általában 10 tf.%-ot meg nem haladó oldószer mennyiséggel biztosítható az aktív poliszaharidot tartalmazó komplex megbontása és ezzel a biológiai hatás növelése. A találmány értelmében a biológiailag aktív 45 vízoldható sejtfal poliszaharidok mikroorganizmusokból történő kinyerésekor úgy járunk el, hogy a táptalaj anyagaitól megtisztított sejt-, illetve micéliumszuszpenziót pH 9—11 vegyhatású vizes közegben, mely 5—40 g/l semle- _. ges sót, előnyösen nátriumkloridot tartalmaz, 25—50 C°-on állandó keverés közben 60—180 percen át kivonatoljuk. Az elegyet a pH 4—7 közötti, előnyösen 6-ra történő beállítása után felforraljuk és szobahőmérsékletre való "hűtés 55 után az oldatlan részeket eltávolítjuk. Az oldathoz ezt követően valamely alkáliföldfém szervetlen sóját, előnyösen kalciumkloridot adunk 0,5—5 g/l mennyiségben, a kivált csapadékot eltávolítjuk, majd ezt követően 9—10 60 közötti pH-értékre lúgosítunk és az így kivált, csapadékokat ismét eltávolítjuk. A nyert tiszta oldathoz a lúgos közeg megtartása mellett térfogatának 0,25—1 részét kitevő vízzel elegyedő szerves oldószert, előnyösen etilalkoholt ada- 65 6 gólunk és a szobahőmérsékleten kiváló csapadékot ülepedni hagyjuk, majd elkülönítjük. Az aktív poliszaharidot tartalmazó csapadékot pH 4—6 közötti értékre történő savanyítás mellett, desztillált vízben oldjuk, és vízzel elegyedő szerves oldószerrel frakcionáljuk, úgy, hogy a 30—66% (tf/tf) koncentráció határok között kicsapódó frakciót gyűjtjük, majd desztillált vízben oldjuk. Az így nyert oldatot 50—100 C" közötti hőmérsékletre, célszerűen C°-ra melegítjük és 3—8 szénatomszámú alifás alkohollal, előnyösen n butanollal telítjük és 5—20 percig e hőfokon tartjuk, majd a szobahőmérsékletre lehűtött elegyből a keletkezett csapadékot eltávolítjuk és a vizes-alkoholos oldatból az aktív poliszaharidot 1,5—2 térfogatnyi vízzel elegyedő szerves oldószer, előnyösen etilalkohol hozzáadásával kicsapjuk és elkülönítjük. Az így nyert termék igen tiszta savanyú poliszaharid, mely elektroforetikus vizsgálatok szerint egy, legfeljebb két komponensből áll és specifikus chearing aktivitása eléri, sőt egyes mikroorganizmusok esetén meghaladja a heparin hatását (8,5 E/testsúly kg/mg 100 E heparin), az utóbbi antikoaguláns hatása nélkül. A készítmény clearing hatását nyulakon a poliszaharid i. v. beadására 1 óra múlva bekövetkező szérumlipoproteinlipáz aktivitásnövekedés alapján vizsgáltuk. Egységnyinek vettük azt az enzimaktivitást, amely 1 ml szérumban a lipoprotein szubsztrátból 37 C°-on 1 óra alatt 1 vM glicerint hasít le. Eljárásunk kivitelezését az alábbi példák szemléltetik: 1. példa: A) 200 g csapvízzel mosott Streptomyces nursei micéliumot {szárazanyagtartalma: 44%, az utóbbi szénhidráttartalma: 10,7%) 1000 ml, 5 g nátriumkloridot tartalmazó, 0,1 n nátronlúggal elkevertük, majd 1 órán át 40 C°-on tartjuk állandó keverés közben. Sósavat adunk hozzá mindaddig, míg a közeg pH-ja 6 nem lesz és felforraljuk. Szobahőmérsékletre történő hűtés után centrifugáljuk és az így nyert 890 ml tükrös .felülúszót 28 ml 10%-os kalciumklorid oldattal hozzuk össze, majd az állás közben kivált csapadékot centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszó folyadék pH-ját 40%-os nátronlúg oldat hozzáadásával 9,7-re állítjuk és a kiváló csapadékot centrifugálás után gyűjtjük. 100 ml desztillált vízben oldjuk úgy, hogy közben sósavval a közeg pH-ját 5-re állítjuk. A nem oldódó részt kiülepítjük, a felülúszóhoz (140 ml) pedig 1.5 tf. (210 ml) etilalkoholt adunk. A csapadékot centrifugáljuk és acetonnal szárítjuk. B) 200 g, csapvízzel többször mosott Streptomyces nursei micéliumot 1000 ml 0,1 n nátronlúgban szuszpendálunk és 1 órán át 40 C°-on kevertetjük. Sósav hozzáadásával a pH-t 6-ra . állítjuk és az elegyet felforraljuk. Szobahőmérsékletre történő lehűtés után a kivált csa-3