150955. lajstromszámú szabadalom • Eljárás primér hidroxil-csoportot tartalmazó szteroidok elkülönítésére, valamint tisztítására és kristályos állapotban való kinyerésére
2 150.955 ki és 55—60% hidrokortizon mellett összesen kb. 20% 11-epihidrokortizon és egyéb ismeretlen szerkezetű termék képződik. A hidrokortizon és melléktermékek tökéletes elválasztása a találmány szerinti eljárással elérhető. A fermentlé extraktumának bepárlásakor kapott kristályos szárazmaradékot 10% vízmentes kalciumkloridot tartalmazó etanolban oldva, az oldatot szűrve, majd diklóretánnal, végül vízzel elegyítve, szteroidhoz kötött oldószeren kívül csak hidrokortizont tartalmazó kristályos anyaghoz juthatunk. Corynebacterium simplex-szel hidrokortizonból nyert prednizolon kristályosítási anyalúgjában feldúsuló ismeretlen szerkezetű szteroidok és egyéb szennyező komponensek gátolják a prednizolon kristályosodását. Az előbbivel azonos módon csak kristályoldószert tartalmazó, tiszta prednizolon kristályosítható, gyakorlatilag kvantitatíve. A találmány szerinti eljárás egyik legelőnyösebb alkalmazása mind izolálási, mind elválasztási szempontból az ún. kombinált fermentációs technológia szerint nyert fermentlevek feldolgozásánál adódott. Ebben az esetben Reichtein-féle S-anyagból Absidia orchidis segítségével hidrokortizont állítanak elő, majd steril körülmények között szűrik a fermentlevet a micéliumtól és a hidrokortizont izolálás nélkül Corynebacterium simplex tenyészetével alakítják át prednizolonná. E kombinált fermentációs lépés természetesen növeli az extraktum szennyezéseinek mennyiségét és a melléktermékek számát. (11-epiprednizolon mellett legalább 6 ismeretlen, ill. ismert szerkezetű szteroid mutatható ki.) Eljárásunk végül új lehetőséget nyújt a gyógyászatban szintén használatos prednizolon-hidrátnak az eddigieknél egyszerűbb előállítására: Prednizolont vízmentes kálciumklorid tartalmú alkoholban oldva, majd az oldatot vízzel hígítva, a hidrát kristályosodik. Az eljárás előnye a predzolon-kalcium komplex nagymérvű oldhatóságában rejlik, így kis mennyiségű alkohol alkalmazásával a kristályosodás egy lépésben gyakorlatilag teliessé tehető Tiszta nT*i=>rlnianionból kiindulva a komplex megbontásánál a vízzel nem elegyedő szerves fázis alkalmazása felesleges. Találmányunk eljárás primer hidroxil csoportot tartalmazó szteroidok elkülönítésére, valamint tisztítására és kristályos állapotban való kinyerésére oly módon, hogy a fermentléből extrakcióval és bepárlással elkülönített szteroid-elegyet alkoholban oldódó szervetlen sókat tartalmazó alkoholban oldjuk, szűrjük, a nyert komplexet egy vagy több oldószer hozzáadásával megbontjuk és az így elkülönített szteroidokat kristályosan kikinyerjük. Alkoholban oldódó sóként vízmentes kalciumkloridot, ill. vízmentes magnéziumkloridot alkalmazhatunk a legelőnyösebben, oldószerként pedig 1—5 szénatomszámú alifás alkoholokat. A komplex oldatának megbontásához vizet, vagy vizet és egy vízzel nem elegyedő szerves oldószert, célszerűen diklóretánt alkalmazunk. A fermentléből extrakcióval és bepárlással elkülönített szteroid elegy helyett prednizolonból kiindulva prednizolonhidrát állítható elő. Eljárásunk kivitelezését az alábbi példák szemléltetik. 1. példa: 10,3 g Reichstein-féle S-vegyületet átalakítunk Absidia orchidis tenyészetével, 16,7 liter fermentlevet nyerünk a micélium szűrése után, mely 360 y/ml hidrokortizon mellett 128 y/ml 11-epihidrokortizont és egyéb szteroidot is tartalmaz. Háromszor 20 tf% diklórmetánnal extrahálunk, majd az egyesített extraktum okát közönséges nyomáson bepároljuk, a nyert 6.8 g nyers kristályos maradékot 13,6 ml 10% vízmentes kalciumkloridot tartartalmazó etanolban oldjuk és oldhatatlan szenynyezéseitől szűrjük. Ezután 13,6 ml diklóretánt adunk hozzá, majd keverés közben 27,2 ml vizet. Hamarosan megindul a fázishatáron a kristályosodás. 72 órán át 0 és +5 C° között tartjuk, majd szűrjük, 10% etanolt tartalmazó diklóretánnal mossuk, szobahőmérsékleten szárítjuk (5,8 g). A kristályokból, melyek kötött diklóretán mellett csak hidrokortizont tartalmaznak, metanolos átkristályosítással 4,8 g hidrokortizont nyerünk. Op. 214 C° [a]D + 158° (c = 1, metanol). Az anyalúgból a vizes fázis extrakciójával és bepárlásával és a diklóretános fázis bepárlásával 0,6 g 11--epihidrokortizon volt nyerhető a tovabbalakításhoz elégséges tisztaságban. 2. példa: 232 g hidrokortizont 300 liter térfogatban oxidálunk Corynebacterium simplex segítségével a 149 062 számú magyar szabadalom szerint. A fermentlé feldolgozását a 149 539 számú magyar szabadalom 2. példája szerint végezzük és 180 g tiszta prednizolönt nyerünk. A kristályosítási anyalúg bepárlásával 25 g barna mézgaszerű anyagot kapunk, melynek prednizolontartalma 9 g. 50 ml 10% vízmentes kalciumkloridot tartalmazó etanolban hidegen feloldjuk, 1,5 g oldhatatlan szennyezéstől megszűrjük, majd 50 ml diklóretánt és keverés közben 100 ml vizet adagolunk. +3 e'en tartva kb. 4 óra után kristályosodás indul meg a két folyadékfázis határán, 72 óra állás után szűrve, kevés vízzel és diklóretánnal mosva, szárítva, 9,1 g kristályos anyaghoz jutunk, mely 88% prednizolönt és 11% vizet, ill. diklóretánt tartalmaz. Etilacetátos oldatát azeotrop desztillációval vízmentesítve, szenezve, majd 10 ml-re bepárolva 7,3 g prednizolon nyerhető, o. p. 229° [a]D : -j-101° (c = 1, dioxán). 3. példa: 20 liter olyan fermentléből indulunk ki, melyben literenként 640 mg Reichstein-féle S-anyagból Absidia orchidis tenyészetének segítségével hidrokortizont nyertünk, majd steril szűrés után a fermentléhez Corynebacterium simplex tenyészetét adagolva prednizolönt állítunk elő. A fermentlé szteroidtartalma literenként 320 mg prednizolon, 120 mg 11-epiprednizolon és még hatféle ismeretlen szteroid. Térfogatra számított 3X20% etilacetáttal kivonatolunk, majd az egyesített kivonatokat szárazra pároljuk. 12,1 g olajos maradékot kapunk, ezt 24,2 ml 10% vízmentes kalciumkloridot tartalmazó etanolban oldjuk, szűrjük, majd 24,2 ml diklóretánt, végül keverés közben 48,4 ml vizet adunk hozzá. Kb. 3 óra állás után
