150245. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hidrokortizon vagy prednizolon előállítására

2 150.245 létre számítva 27% körüli hidrokortizon átalakítást tudtak elérni. Az U. S. 2,875134 számú szabadalom szerint Epicoccurn törzsekkél melléktermékek keletkezése mellett 10—20% közötti hidrokortizon átalakítás volt elérhető. Az U. S. 2 876 170 számú szabadalomban leírt eljárással, Spondylodaudium austräte és Spondyloclaudium xylogenum törzseket alkalmazva 20% körüli hidrokortizon átalakítást értek el. Az U. S. 2 936 264 számú szabadalom szerint Rhodoseptoria törzs képes szteroidokat 11/^helyzetben oxidálni. Az ismert eljárások hátrányait, mint fentiekből kitűnik, elsősorban az alacsony átalakítás és a nemkívánatos melléktermékek keletkezése képezik. A leírt eljárások túlnyomó része inkább elvi jelentőségű és műszaki, valamint gazdasági okokból nem látszik alkalmasnak nagyipari megvalósításra. Különösen hátrányos a melléktermékek keletkezése, amelyek a hidrokortizon elkülönítését csak igen körülményesen, iparilag nem alkalmazható finompreparatív módszerekkel, gyenge kitermeléssel teszik lehetővé. Vizsgálataink során arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy az általunk izolált és az Országos Közegészségügyi Intézetnél 1961. október 20-án 611020 1 szám alatt letétbe helyezett Absida orchidia törzs Reichstein-féle S-vegyületet igen jól képes hidrokortizonná átalakítani, amely átalakítás során a nemkívánatos melléktermékek olyan minimális mennyiségben keletkeznek, ami lehetővé teszi a keletkezett hidrokortizon viszonylag egyszerű módon történő elkülönítését a beadagolt Reichstein-féle S-vegyületre számítva 45—50%-os kitermeléssel. Ilyen kedvező eredményt adó iparilag is alkalmazható eljárás eddig az irodalomban nem volt ismeretes. Az általunk izolált Absidia orchidis törzs a Phycomycetes osztály Mucorales rendje- Mucoraceae családjához tartozó Absidia faj egyik speciese, amelynek tulajdonságai megfelelnek a rendszertanban leírtaknak (J. C. Gilman: Manual of Soil Fungi, The Iowa State College Press, 3rd printing, [1950]). Törzsünk vizsgálata során azt a meglepő felismerést tettük, hogy egyes természetes alkotórészeket (pl. pepton, malátakivonat stb.) tartalmazó táptalaj használata esetén a Reichstein-féle S-vegyületet mindössze 30%-ban képes hidrokortizonná alakítani. Vizsgálataink során kimutattuk, hogy a jelenség oka egyes természetes táptalajalkatrészekben található oxidációt gátló anyagok jelenlétének tulajdonítható. Ha ugyanis a tenyészetet steril vízzel mosva a micélium mellől a táptalaj megmaradt alkotórészeit eltávolítottuk, a micéliumot pedig steril vízben szuszpendáltuk, az átalakítás 60%-ot meghaladó mértékben zajlott le. Tekintettel arra, hogy a mosott micélium alkalmazása ipari méretekben nehézkes, kiterjedt kísérleteink során olyan összetételű táptalajt dolgoztunk ki, amelyben a tenyésztés során nem szaporodhatnak fel az oxidációt gátló anyagok. Táptalajunk ammoniumsizulifatot, glükózt és kukoricalekvárt tartalmaz alkotórészként. Táptalajunkat alkalmazva az eljárás során kevés nemkívánatos és az elkülönítást megnehezítő szteroid melléktermék keletkezik. Táptalajunk további előnye az, hogy csak minimális mennyiségben tartalmaz szerves oldószerekkel extrahálható anyagokat és így a termék elkülönítése viszonylag egyszerűen megoldható. A kinyerhetőség tovább javítható azáltal, ha a tenyészetet steril vízzel térfogatának kétszeresére hígítva alkalmazzuk. Ismeretes jelenség, hogy a hasonló mikrobiológiai oxidációk lefolyását bizonyos koncentrációk fölött a beadagolt szteroidok is gátolni képesek. Vizsgálataink szerint 160 mg Reichotein-féle S-vegyület/liter az a haitárkoneentráeió, amely 'mellett törzsünk alkalmazása esetén az oxidáció viszonylag gyorsan, 4—6 óra alatt optimálisan lezajlik. 200 mg/liter koncentráció esetében az oxidáció csak lényegesen hosszabb idő, 16—24 óra alatt zajlik le. Ez az ipari alkalmazás szempontjából előnytelen körülmény vizsgálataink szerint úgy küszöbölhető ki, ha az átalakítandó szteroidot szakaszosan adagoljuk a tenyészethez és így koncentrációját mindenkor alacsonyabban tartjuk, mint a kritikus 200 mg/liter határérték. Ily módon 1 liter tenyészlére számítva 600—800 mg Reichstein-féle S-vegyület alakítható át eljárásunkkal. Vizsgálataink fontos felismerése az is, hogy a szteroid szubsztrátumot alacsony szénatomszámú alkoholban oldva adagoljuk. Előnyösen metilalkoholt, vagy etilalkoholt alkalmazhatunk. Az alacsony szénato mszámú alkoholok jelenléte azért lényeges, mert hiányukban az átalakítás mintegy 20%-kal gyengébben zajlik le. További előnye az általunk alkalmazott mikroorganizmusnak és fermentációs körülménynek, hogy az organizmus apró göbök alakjában nő és így a tenyészettől igen könnyen és steril körülmények között kiszűrhető. A keletkezett hidrokortizon kvantitatíve az élesre szűrt fermentlében van jelen és abból ismert módon kinyerhető. Prednizolon előállítása céljából eljárhatunk úgy, hogy a hidrokortizont tartalmazó szűrt fermentléhez 1/25—1/40 térfogat, előnyösen 1/30 térfogat megfelelő denzitású Corynebacteriurn simplex tenyészetet adunk (utóbbi előállításának módját lásd a 149 062 számú magyar szabadalomban és a fermentációt lefolytatjuk. Az így nyert fermentátumból az izolálható prednizolon menynyisége azonos ugyanennek a fermentátumnak egy másik aliquotjából kinyerhető hidrokortizon mennyiségével. Az általunk alkalmazott fermentációs eljárás tehát lehetővé teszi Reichstein-féle S-vegyületből a hidrokortizon üzemszerű előállítását, vagy a keletkezett hidrokortizon közibeeső, költséges és munkaigényes izolálása nélkül, a prednizolon közvetlen előállítását igen gazdaságos és nagyüzemi méretekben is kivitelezhető módon. Eljárásunk nyújtotta további lehetőség a fermentátumból kiszűrt micélium többszöri felhasználása a Reichstein-féle S-vegyület átalakítására hidrokortizonná. Az előzőkben leírt szűrés után a micéliumot ugyanis steril csapvízben szuszpendálva, az újból felhasználható szteroidok oxidálására és így megtakaríthatók azok az anyagok és munkálatok, amelyek szükségesek megfelelő minőségű Absidia orchidis micélium-tömeg előállítására. A mícélumot az újból felhasználás után