150245. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hidrokortizon vagy prednizolon előállítására
150.245 3 kiszűrve a tenyészetből, természetesen a szűrt léhez a fentebb ismertetett módon C. simplex tenyészetet adagolva, á közvetlen prednizolon előállítás ugyancsak kivitelezheiő. Találmányunk eljárás hidrokortizon vagy prednizolon előállítására Reichtein-féle S-vegyületből (17« 21-dioxiprogeszteronból) melyre jellemző, hogy az átalakítást Afosidia orchidia species, aanmonszulfátot, glükózt, kukoricalekvárt tartalmazó táptalajon nőtt, hígítatlan, vagy hígított tenyészetével végezzük, az átalakítandó szteroidot alacsony szénatomszámú alkoholban, oldva, szakaszosan adagoljuk a tenyészethez oly módon, hogy koncentrációja a 200 mg/l értéket ne haladhassa meg, az átalakítás megtörténte után a fermentlevet a micéliumtól elválasztjuk, a hidrokortizont a fermentléből ismert módon elkülönítjük, a micé-liumot pedig steril vízben sziuszpendálva újra felhasználjuk a Reichstein-féle S-vegyület átalakítására, vagy a hidrokortizon elkülönítése nélkül a szűrt fermentlébe Corynebacterium simplex tenyészetet belehígítva a fermentlé hidrokortizontartalmát prednizolonná alakítjuk, amit az átalakítás befejeztével ismert módon elkülönítünk. Eljárásunk kivitelezését az alábbi példák szemléltetik: 1. példa: Roux palackban nőtt 12 napos burgonyás agartenyészetről 100 ml desztillált vízzel készítettünk spóraszuszpenziót. 1—1 ml spóraszuszpenzióval oltottunk be 15 db, 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban, 121 C°-on, 15 percig sterilezett, 100—100 ml Oj jelű táptalajt. Az Oj táptalaj összetétele: 2% malátakivonat és 1% pepton (Richter) csapvízben, a pH-t sterilezés előtt 5,5-re állítottuk. A beoltott tenyészeteket 25 C°^os termosztát szobában 200-as fordulatszámú rázóasztalon inkubáltuk 24 óra hosszat és 3—3 lombik összeöntött tartalmával oltottunk 5 db, 5 liter steril Oi táptalajt tartalmazó üvegfermentort. A fermentorokat 25 C°-os vízfürdőben percenkénti 300-as fordulatszámmal kevertettük és percenként 5 liter steril levegőt áramoltattunk át a tenyészeteken. 48 óra múlva, steril körülmények között összeszűrtük az 5 db fermentor tartalmát, a micélium tömeget pedig 5 felé elosztva, 5—5 liter steril csapvízben szuszpendáltuk és a szuszpenziókat 5 db f er mentorba betöltöttük. A fermentációs körülmények azonosak voltak a tenyésztésnél leírtakkal. Az 1. fermentorhoz 500 mg, a 2. fermentorhoz 600 mg, a 3. fermentorhoz 700 mg, a 4. fermentorhoz 800 mg, az 5. fermentorhoz 100 mg Reichstein-féle A 2. táblázat adatai szerint ilyen tenyésztési mód mellett gyorsabb az oxidáció mint az 1. példában megadott körülmények között. A fermentátumból 100—100 ml-t háromszor 1/3 térfogat • etilacetáttal extrahálva, az extraktumot bepároiva S-vegyületet adagoltunk 100 ml etilalkoholban feloldva. A tenyészetekben: kénsavas kromogénes meghatározási módszerrel vizsgáltuk a Reichsteinfélie S-vegyület eltűnését (Mizsei A., Szabó A., J. Biochem. Microbiol. Techn, Eng., 3, 21 [1961]). Az eredményeket az 1. táblázat foglalja össze. 1. táblázat. 0 2 4 6 8 10 12 14 16. óra 1. fenn. 98 51 16 7 7 2. ferm. 114 78 26 11 6 3. ferm. 123 79 30 6 3 4. ferm. 147 88 34 7 7 5. ferm. 180 129 88 44 26 15 12 12 8 A táblázatban közölt számok a fermentátum Reichteiin-féle S-vegyület tartalmát jelöli y/ml-ben kifejezve. Az 1. táblázat adatai szerint 500—800 mg Reichstein-féle S-vegyületet adagolva, az átalakítás 6 óra alatt megtörténik, de 1000 mg adagolása esetén az oxidáció már 16 órát vesz igénybe. 2. példa: A tenyészetek oltása az, 1. példában leírt módon történt, azzal a különbséggel, hogy 3—3 db Oi rázott tenyészettel kétszer 5 liter GAKs-as táptalajt oltottunk üvegifermentorban. GAKs táptalaj összetétele: 1% techn. glükóz, 0,5% ammóniumszulfát, 2% kukoriicalekvár csapvízíben, a táptalaj pH-ját sterilezés előtt 10 n natriumhidroxiddal 6,5-re állítottuk be. A fermentorokban a tenyésztési körülmények azonosak voltak az 1. példában leírtakkal. A 2 db 48 órás tenyészetet összeszívtuk és keverés közben háromszor 2,5 litert az egyesített tenyészetből steril edénybe kiszívtunk és 2,5—2,5 liter steril csapvizet tartalmazó fermentorhoz adagoltuk. Az így nyert, kétszeresen hígított tenyészetekhez különböző oldószerekben oldva négyszer 800 mg Reiiöhsteim-féle S-vegyületet adagoltunk. Adagolás módja: 1. fermentor 4X&0 ml etilalkoholban, 2. fermentor 4X8 ml 10% kálciumklorid tartalmú metilalkoholban, 3. fermentor 4X8 ml 10% kálciumklorid tartalmú metilalkoholban és az adagolás időpontjában mindig 72 ml etilalkoholt adagoltunk ehhez a fermentotrhoz. Adagolások időpontja: 0, 6., 12., és 18. óra, A fermentoroikból a Reichstein-féle S-vegyület eltűnését a 2. táblázat mutatja be. és a koncentrátumból a fermentátum hidrokortizon tartalmát kvantitatív papírkiromaitográfiával meghatározva, a beadagolt Reiefastein-féle S-vegyületre számolva az 1. fermentorban 62%-os, a 2. fermentorban 44%,-os, a 3. fermentorban 2. táblázat. ~0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20~~22 24. óra LlerrrZ 144 37 ~Ő 0 64 19 11 120 44~~25 130_ 97^57 2. ferm. 150 32 0 0 35 24 13 40 16 13 137 26 13 3. ferm. 150 44 0 0 44 22 16 81 32 18 96 53 40
