149538. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cianokobalamin-monokarbonsav előállítására

149.538 íenol-széntetrakloridos oldathoz azonos térfogat 50%-os vizes acetont adunk, hogy a cianokobalamin nionokarbonisavat vizes oldatba vigyük át. Az acetonos kivonást kis részletekben, mindaddig folytatjuk, míg az oldószeres rész vörös színt már nem tartalmaz. A vizes oldatból a szerves oldószer nyomokat vákuumdesztillációval távolítjuk el. Ezután 0,3 g aktív szenet adunk hozzá, nuescsoljuk, a szenet vízzel átmossuk és 60 C°-os 67%-os vizes etanollal eluáljuk. Az eluátumot vákuumban kb. 0,5—1 ml-re bepároljuk. 1 napig 5 C°-on tartjuk. A vaskos, tű alakú kristályokat nueesoljuk, minimális jeges vízzel átmossuk és levegő áfszívatással szárítjuk. A fenti módon 9,6 mg cianokobalamin-monokarbonsavat nyer tünk, amely elektroforetikus és papírkromatográfiás vizsgálatok szerint egységes. A lúgos vizes közeg extrakcióiakor kapott, összegyűjtött fenoi-széntetrakloridos kivonatok tartalmazzák a Bi2-vitamirit. A fenolos oldatból a Bi2-vitamint 50%-os vizes acetonnal összerázva vizes oldatba visszük át. Egyszeri szenes adszorbció után kristályosítjuk. 70 mg kristályos Bi2-vitamint kaptunk a fenti módon. 2. példa: 1 m3

hasznos űrtartalmú, keverővel ellátott saválló acél készülékben az első példában leírt összetételű táptalaj 1000 literét sterilizáljuk 120 C°-on 1 óra hosszat. Beoltjuk 10% PBS 77 Propionibacterium shermanii törzs azonos összetételű táptalajon készült oltóanyagával, amelyet úgy nyerünk, hogy a 400 ml-es törzstenyészettel előbb 10 liter, majd 100 liter táptalajt oltunk. Az átoltások 6 naponként történnek. Az 10O0 literes tenyészetet 6 napig sterilen 28—30 C°-on tartjuk és 2 óránként enyhén megkeverjük. A fermentálás befejezése után 2,8 g Bi2-vitamininäk megfelelő E. coli aktivitást tartalmaz az oldat. A férni entlevet 1 órán át főzzük, majd kihűlés után pH 2,5-re savanyítjuk és 2% derítőföldet adunk hozzá. 1 órai keverés után lecentrifugáljuk az :idszorbenst és ammóniával pH 8,5—9,0-ra lúgosított 70%-os vizes etanollal eluáljuk. Az etanolos eluálást 3-szor megismételjük, közben a derítőföldet nueesoljuk. Az összegyűjtött etanolos oldatokat semlegesítés után vákuumban 10%-ára bepároliuk. l%,j NaCN-t és 20% (NH4)

2

S0

4

-et adunk hozzá és 3 részletben összesen 20%-nyi benzilaikohollal kivonatoljuk. A benzilalkoholos oldathoz azonos térfogatú 2: 1 arányú benzin-benzol elegyet és féltérfogat vizet adunk, hogy a B-vitamint és a cianokolabamin-moiiokarboinsavat vizes oldatba vigyük. A vizes kivonást még kétszer megismételjük. A vizes oldathoz 150 g aktív szenet adunk, nueesoljuk, a nuccson 0,5% NaCN tartalmú vízzel mossuk, majd 67%-os vizes etanollal eluáljuk. Az etanolt vákuumdesztillációval eltávolítjuk. Az így kapott vizes koncentrátum együtt tartalmazza a Bi2-vitamint és cianokobalamin-monokarbonsavat. A két anyag elválasztása a következő módon történik: A vörös színű vizes oldatot 3% NaHCOs hozzáadásával pH 8-ra lúgosítjuk és fenolkloroform 1 : 4 elegyével kivonatoljuk mindaddig, míg a fenolos fázis már alig rozs?színű. Az egyesített fenolos kivonat tartalmazza a Bi2-vitamint;

amelyet az 1. példában leírt módon izoláltunk. 1,3 g kristályos Bi2-vitamint nyertünk a fenti módon. A cianokobalamin-monokarbonsavat tartalmazó lúgos vizes oldatot pH 2,5-re savanyítjuk és folytatjuk a íenol-kloroíorm i : 4 eleggyel a kivonatolást -mindaddig, míg a fenolos fázis már alig rózsaszínű. A vizes fázis sárgásbarna marad. Az egyesített fenolos kivonatot 5'0%-os vizes acetonnal összerázva a cianoko'balamin-monoka-pbonsav a vizes fázisba megy át. A vizes oldathoz 2 g aktív szenet adunk, fél óra állás után a szenet lenuccsoljuk, desztillált vízzel alaposan átmossuk, majd 67%-os vizes etanollal leoldjuk róla a cianokobalarnin-monokarbonsavaí. Vákuumdesztillációval etanolmentesítjük és kis térfogatra betöményítjük. Az így kapott tömény ví

ze

c oi-intWíl kihű^kor már megkezdődik a I i b+ ü ^ 71 Í i t T on tjrtva vastag krist ' c 1 , di1

i _,e pa G4-es üvegszűrőn r v

ni A ti mossuk, vákuum-1 n 'di +

i ik i i

u

meitreiós léből 92 mg kristályos cianokobaiamm-monokarbonsavat nyertünk, amely papírelektroíoretikus és papírkromatográíiás vizsgálatok szerint egységes. 3. példa: 20 m3

térfogatban fermentálunk PBS 77 Propionibacterium shermanii törzset a 2. példában leírt módon. A fermentálás befejezésekor 31,2 g Bi2-vitamint tartalmaz; A baktériumokat centrifugálással távolítjuk el. A baktérium szuszpenzicból a Bi2-vitamin és a cianokobalamin-monokarbonsav együttes kinyerése az 1. példában leírt módon történik. A szenes adszorbció után kapott tisztított kivonat együtt tartalmazza a B ^"Vitamint és cianokoibalamin-monokarbonsavat. A kettő elválasztása ioncserélővel a következő módon történhet: 800 g OH-ciklusban levő, vízzel lúgmentesre mosott erősbázisú ioncserélő Amberlite IRC. 410 oszlopon átengedünk 2 liter komcentrátumot, amely 19,6 g Bi2-vitamint és 2,15 g cianokobalamin-monokarbonsavat tartalmaz. A koncentrál átengedése után addig mossuk desztillált vízzel a gyanta oszlopot, míg a mosóvíz már nem rózsaszínű. Az átfolyt lé és a mosóvíz a kiindulási B-vitamin egész mennyiségét tartalmazza. A gyantán megkötött monokarbonisavat 50% acetont tartalmazó 0,01n HCl-al eluáljuk. A leoldáshoz 800 ml oldószer szükséges. Semlegesítés után vákuumdesztillációval oldószermentesítjük. A kapott koncentrát fotometriásan meghatározva 1,8 g cianokobalamin-monokarboinsavat tartalmaz. A vizes oldatban levő ciánokobalamin^monokarbonsavat 2. példában leírt módon szenes adszorbcióval tisztítjuk. Az etanol, lepárl n addig adunk a tömény vizes oldathoz acetont, míg az oldat • kissé megzavarosodik. Másnapig 5 C°-on tartjuk. A kivált tű alakú kristályokat, szűrjük, 3'0%-os vizes acetonnal mossuk és szobahőn szárítjuk. Termelés 1,5 g cianokobalamin-monokarbonsav.' 4. példa: 100 litert fermentálunk az 1. példában leírt módon. A fermentlé 257 mg Bi2-vitamin aktivitást tartalmaz, A feldolgozás az 1. példában leírt