149538. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cianokobalamin-monokarbonsav előállítására
4 149.538 módon centrifugálással, etanolos kivonással és szenes adszorbcióval történik. A szenes adszorbdó után kapott vizes oldat 151 mg Bi2-vitamint éa 26,1 mg cianokobalamin-monokarbonsavat tartalmaz. A koncentrátot 10 db, kb. 50 ml térfogatú kamrából álló elektrodializáló készülék egy kamrájába tesszük. A készüléket 0,1 mol pH 6,8 foszfátpuff err el töltjük meg. 220 Volt feszültség mellett 3 órán át elektrodializálunk. Az anódosan vándorló cianokobalamin-monokarbonsav és a Bi2-vitamin közötti kamrában levő oldat csak alig rózsaszínű. A fenti módon szétválasztott Bj2-vitamint és a cianokobalamin-monokarbonsavat szenes adszorbcióval tisztítjuk. A Bi 2-vitamint vizes acetonból, a cianokobalamin-monokarbonsavat forró vízből kristályosítjuk. Termelés 132 mg Bi2-vitaimin és 23,1 mg cianokobalamin-monoíkarbonsav. 5. példa: 1 m3 hasznos űrtartalmú, keverővel ellátott saválló acél fermentor készülékben a következő táptalaj 1000 literét sterilizáljuk: 2% élesztő szárazanyagnak megfelelő préselt élesztőt 45 C°-on Eiutolizálunk 10 órán át. Az autolizátumból az oldatlan részt kicentrifugáljuk és a felül úszó tiszta oldatot használjuk fel. A táptalaj ezenkívül 2% glükózt, 1% CaC03 -at, 5 gamma/ml 'Co(N0 3 ) 2 -t éts 1 gamma/ml 5,6-dimetilbenzimidazolt tartalmaz. A táptalajt beoltjuk 10% Propionibacterium freudenreichii törzs azonos összetételű táptalajon készült tenyészetével. . Az 1000 literes tenyészetet 6 napig sterilen 28—30 C°-on tartjuk és 2 óránként enyhén megkeverjük. A fermentálás befejezése után 2,57 g Bi2-vitaminnak megfelelő E. coli aktivitást tartalmaz az oldat. A fermentléből centrifugálással választjuk el a baktériumokat. A szupernatánst előirtjuk. A baktérium szuszpenziót 30 liter 0,05% NaCN-tarfalmú 50%-os vizes acetonnal 1 órán át főzzük, majd szűrjük. A vizea acetonos kifőzést még kétszer 15 literrel megismételjük. Az összegyűjtött vörös színű oldatokat vákuumban, acetonmentesre pároljuk. A tömény vizes oldathoz 140 g aktív szenet adunk. Fél óra állás után nuccsoljuk. Kevés vízzel átmossuk a szenet, majd 60—70 C°-os 67%-os vizes etanollal eluáljuk. Az eluátumot vákuumban etanolmentesítjük. A vizess oldatot 10%-os ammóniával pH 8-ra lúgosítjuk és fenolkloroform 1 :5 eleggyel kivonatoljuk mindaddig, míg a fenolos fázis már alig rózsaszínű.- Ezután a vizes részt HCl-el pH 3-ra savanyítjuk és folytatjuk a fenol-kloroíormos kivonatolást mindaddig, míg az oldószer már alig rózsaszínű. A savanyítás után kapott fenolkloroformos oldathoz négyszeres térfogat étert és fél térfogat vizet adunk, hogy a cianokobalaminmonokanbonsavat vizes oldatba vigyük át. Ezután a vízzel való kivonatolást mindaddig folytatjuk kis részletekben, míg az oldószeres rész vörös színt már nem tartalmaz. A vizes oldatból a szerves oldószer nyomokat vákuumdesztillációval távolítjuk el. Ezután 0,5 g aktív szenet adunk hozzá, nuccsoljuk, a szenet vízzel átmossuk és 60—70 C°-os 70%-os vizes etanollal eluáljuk. Az eluátumot vákuumban szárazra pároljuk és annyi forró vizet adunk hozzá, amennyi az oldáshoz feltétlenül szükséges. Két napig 5 CD -on tartjuk. A kivált kristályokat nuccsoljuk, minimális jeges vízzel átmossuk és levegő átszívatással szárítjuk. A fenti módon 2,2 mg cianokobalamin-monokarbonsavat nyertünk. A lúgos-vizes oldat extrakciójakor kapott összegyűjtött íenol-kloroformos kivonatok tartalmazzák a B12-vitamint. Ebből az oldatból a Bi 2-vitamint 4-szeres térfogat éter és féltérfogat víz hozzáadásával vizes oldatba viszszük át. Egyszeri szenes adszorbció után kristályosítjuk. 810 mg kristályos Bi2-vitamint kapunk a fenti módon. 6. példa: 100 litert fermentálunk az 1. példában leírt módon. A fermentlé 318 mg Bi2-vitaminaktivitást tartalmaz. A feldolgozás az 1. példában leírt módon centrifugálással, etanolos kivonással és szenes adszorbcióval történik. A szenes adszorbció után kapott vizes oldat 180 mg Bi2-vitamin és 30,6 mg cianokobalamin-monokarbonsavat tartalmaz. A sómentes koncentrátot ioncserélő cellulóz oszlopon kromatografáljuk a következő módon: 30 g dietilaminoetilcellulóz (DEAE Zell. Schleicher—Schüll) porból vízzel oszlopot készítünk és a fenti vizes koncentrátot átengedjük rajta. A B] 2-vitamint vízzel kimossuk az oszlopról. Az így kapott oldatot vákuumban kis térfogatra betöményítjük és négyszeres térfogat aceton hozzáadásával kristályosítjuk a Bi 2-vitamint. Termelés 162 mg B12-vitamin. Az oszlopon megkötött monokarbonsavat 1%-os vizes NaCl oldattal oldjuk le. Az így kapott oldatot 1 g szénre adszorbeáljuk, erről 67%-os etanollal leoldjuk, vákuumban etanolmentesítjük. A cianokobalamin-monokarbonsavat vízből kristályosítjuk. Termelés 25,2 mg. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás a Bi2-vitaminnal antagonista hatású, aktív cianokobalamín-monokarbonsav-izomer fermentációs úton való előállítására, amelyre jellemző, hogy a PBS 77 jelzésű, az OKI-nél 601 013 szám alatt letétbe helyezett Propionibacterium shermanii törzset fermentáljuk, majd az ily módon adódó fermentlében, vagy az abból előállított koncentrátumban jelenlevő aktív cianokobalamin-monokarbonsav-izomert és Bj 2-vitamint egymástól elválasztjuk és kívánt esetben izoláljuk. 2. Az 1. igénypontban meghatározott eljárás foganatosítási módja, amelyre jellemző, hogy a fermentációhoz táptalajként pantoténsavat és biotint tartalmazó, állati vagy növényi eredetű fehér j ehidrolizátumot, előnyösen kukoricalekvárt vagy élesztőhidrolizátumot alkalmazunk. 3. A 2. igénypontban meghatározott eljárás foganatosítási módja, amelyre jellemző, hogy a fermentációt mikroaerob körülmények között, 5,6--dímetil-benzimidazol jelenlétében, 25—30 C°-on végezzük el. 4. Az 1. igénypontban meghatározott eljárás foganatosítási módja, melyre jellemző, hogy a fermentléből, ill. az abból előállított koncentrátumból lúgos közegben, előnyösen 7,5—8,5 pH-érték mellett, vízzel nem elegyedő szerves oldó-
