148963. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új nagyhatású antibiotikum előállítására
148.963 3 szm oldószer szárazanyag színtelen kloroform halványsárga kloroform 8 mg sárga kloroform 26 mg halványsárga kloroform 8 mg csaknem színtelen kloroform 1 mg 12 mg sötét vörösbarna kloroform: MeOH 20:1 1. . 10 200 színtelen kloroform 2. 12 12500 halványsárga kloroform 8 mg 3. 13 39000 sárga kloroform 26 mg 4. 11 7900 halványsárga kloroform 8 mg 5. 12 580 csaknem színtelen kloroform 1 mg 12 mg 6. 10 2100 sötét vörösbarna kloroform: MeOH 20:1 7. 15 540 vörösbarna kloroform: MeOH 20:1 8. 13 50 narancsbarna kloroform: MeOH 20:1 9. 16 500 pirosasbarna metanol 10 mg 10. 13 100 pirosasbarna metanol 11. 12 20 pirosasbarna metanol 12. 15 250 szürkészöld metanol: n HCl 1:1 13. 20 40 szürkészöld metanol: n HCl 1:1 2500 ml szárított étert öntünk, majd az éteres elegyet jó hűtő alatt 5 percig forraljuk. A narancssárga éteres oldatot (650 000 ml) leszűrjük az oldhatatlan maradékról (8,2 g 6000 E/mg) és bepároljuk. Az olajos maradíkot (3,2 g) 20 ml kloroformmal oldjuk és 100 g A12 03-ból készült kromatográfiás oszlopra visszük. Eluálást kloroformmal végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot acetonnal felvesszük és 4 ml cc sósav, valamint 1000 ml absz. éter hozzáadásával lecsapjuk a sárga sósavas sót. Szűrjük, mossuk absz. éterrel és exikátorban szárítjuk. Kapunk 800 mg élénksárga amorf K—152.HCl-t. Aktivitása 65 000 E/mg. Kitermelés 13%-3. példa: A 2. alatti példa szerint nyert fermentlé 300 liter savanyúan szűrt, majd neutralizált térfogatába 3 kg Norit jelzésű szenet keverünk. A keverést 20 percig végezzük, mivel hosszabb keverés esetén, a pigmens anyagok jelentős része is megkötődik. A szenet szűrjük, addig mossuk, amíg a mosóvíz színesen jön. le, majd sósavval pH = = 2-re beállított 50%-os vízzel acetonnal az aktív anyagot leoldjuk. Az eredeti fermentlé aktivitásának 80%-a 15 liter vizes acetonnal leoldható. Az aceton nagy részének lehajtása után az oldat pH-ját 6,5—7-re állítva a hatóanyagot kloroformba visszük át, majd az előbbi példában megadott módon többszöri vizes kloroformos átrázással a neutrális szennyezésektől megszabadítjuk. A fenti 2. és 3. példa szerint nyert koncentrátum az alábbiak szerint tisztítható tovább: a nyers bázist (kb. 60 mg, 1000 000 E) 10 ml kloroformban oldva, 30 g savval előkezelt alumíniumoxidot tartalmazó kromatografáló oszlopra vive, különféle oldószerekkel eluálva több frakcióra bontható szét. eluáló oldószer szárazanyag sűrűsödik és alkalmas a fermentor oltására. Az inokulumtankban való tenyésztés alatt a fermentort 250! fordulatú turbó-keverővel keverjük és azt 1 térf. levegővel levegőztetjük. Az átoltás 300 literes fermentorba történt, melynek kezelése az inokulumtank kezelésével teljesen megegyezett és a 24. órában 100 E/ml, a 40. órában 1430 E/ml, a 46. órában I860 E/ml termelést figyelhetünk meg. 300 literes fermentáció feldolgozása. A 300 literes oldat feldolgozása pH = 2 értékre való savanyítás után történő szűréssel kezdődött, amikor is 280 liter térfogatú 1680 E/ml hatóanyag tartalmú oldatot nyertünk. Ezt 5 n NaOH-val pH = 7-re állítjuk, majd 2-szer 25 liter kloroformmal extraháljuk. Az egyesített kloroformos extraktumokat (46 liter, 8800 E/ml) vákuumban bepároljuk. Bepárlási maradék kb. 3 liter (140 000 E/ml), összesen 420 000 000 E. A bepárlás után visszamaradt 2910 ml sötét vörösbarna kloroformos oldatot 1000 ml petroléterrel elegyítjük, majd extraháljuk háromszor 600 ml 0,01 n sósavval. A keletkezett stabil emulzió megbontható kevés etilacetáttal. A borvörös sósavas extrakt 1580 ml, 116 000 E/ml. A kiextrahált szerves fázis aktivitása 400 E/ml. Az egyesített vizes fázisokat jéghűtés mellett 2 n NaOH-val pH = 6,5—6,8-ra állítva extraháljuk kétszer 500 ml kloroformmal. Az egyesített kloroformos extraktok: 400 OO'O E/ml (980 ml). Extrakciós maradék: 1800 E/ml. A kloroformos részt 400 ml petroléterrel elegyítve extraháljuk kétszer 200 ml 0,01 n sósavval; kapunk 390 ml 295,000 E/ml aktivitású vizes fázist (extrakciós maradék 160' E/ml), ezt pH = 6,5-re állítva extraháljuk kétszer 150 ml kloroformmal. 290 ml 950 000 E/ml kloroformos oldat és 810 E/ml extrakciós maradékot kapunk. Kinyerés 275 500 000 E (65%)Kloroformot vákuumban 30—33 C°-oi.n bepárolva kapunk 18 g vörösbarna olajat. Az olajra Frakció ml E/ml 800 000 E A 2., 3., 4. frakciókat vákuumban szárazra párolva vörösbarna szilárd anyag nyerhető. Aktivitása 40 000 E/mg. A 6. frakcióból kinyert sötét színű anyag valószínűleg azonos a nagy aktivitású termékből lúg és hő hatására keletkező anyaggal. Hasonló biológiai aktivitásuk és teljesen azonos ultraibolya spektrumuk bizonyítja ezt. Ha feldolgozásnál csak a nagy aktivitású (2—4) frakciókra vagyunk tekintettel, a frakcionált kromatográfia helyett elegendő a tömény (100 000 E/ml-es kloroformos oldatnak megfelelő mennyiségű [1/10]) alumíniumoxiddal való kezelésié is.
