148963. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új nagyhatású antibiotikum előállítására

2 148.963 Lakmusz-tej: erőteljes savképzés, majd peptonizálás (28 C°). Plotho táptalaj: jól nő, spórásodó levegőmicélium színe szürkés, oldódó pigmentet nem termel <28 C°). Egyszerű zselatin: szúrási tenyészetben néhány nap múlva mérsékelten folyósítja, barnás oldódó pigmentet termel (20—22 C°). Húsleves zselatin: szúrási tenyészetben mérsékelten folyósít, barnás oldódó pigmentet termel (20—22 C°). Nitrátredukció: nem redukál (28 C°). Haemolízis: nem hemolizál. D-tartarát-ot nem erjeszti (28 C°), Szaccharózt, laktózt, dextrózt, mannitot, maltózt, mannózt, arabinózt, galaktózt, laevulózt, rhamnózt, raffinózt, xilózt, trehalózt, dulcitot, inozitot, szorbitot, szorbózt, adonitot, szalicint és inulint nem erjeszti, dextrózban sok, szaccharózban, laktozban, mannitban, maltozban, mannoz-. ban, arabiinozban és trehalozíban kevés oldódó pigmentet termel (peptonvíz, 28 C°). Az antibiotikum termelése nem korlátozódik a fenti leírásnak megfelelő törzsre, hanem kiterjed annak előállítható mutánsaira és variánsaira. Az antibiotikum termelése a Streptomyces törzs süllyesztett aerob tenyésztésével történik steril körülmények között, az antibiotikumok előállítására használatos készülékekkel. így pl. a termelés történhet úgy, hogy burgonyás ferdeagaron tenyésztjük a Streptomyces törzset, a keletkező spórákat víz segítségével lemossuk és a kapott spóraszuszpenzióval beoltjuk az 500 ml-es Erlenmeyer lombikban levő 200 ml steril és megfelelő összetételű táptalajt. Az Erlenmever lombikot 28 C°-on termosztát szobában levő rázógépre helyezzük. A fermentáció 80—130 óráig tart, de eljárhatunk ügy is. hogy az antibiotikum iparban használatos „többlépcsős tenyésztési módszert" használjuk. A spóraszuszpenzióval beoltott, 24 óráig rázatott tenyészetekkel 100 liter térfogatú, a megfelelő összetételű steril táptalajt tartalmazó inokulum fermentort oltunk és 48 óráig 28°-on levegőztetve és keverve folytatjuk a tenyésztést, majd ezzel oltunk 1000 literes hasznos térfogatból és ugyancsak steril táptalajt tartalmazó fermentort. A tenyésztést 50—90. óráig folytatjuk keverés és levegőztetés közben. A táptalaj tartalmaz nitrogénforrásként szójalisztet, amerikai mogyoró-lisztet, kukoricalekvárt, kazamint, energiaforrásként glükózt, keményítőt, laktózt, szaccharózt, továbbá anorganikus sókat a növekedés elősegítésére és a táptalaj pH-jának állandósítására. A habzás megakadályozása olaj segítségével történhet. A legmegfelelőbb táptalaj tartalmaz 2% szójalisztet, 3% glükózt, 0,5% kukoricalekvárt, 0,1% kazamint, 0,3% nátriumkloridot, 0,5% káleiumkarbonátot. pH sterilezés után 7-es. A táptalaj készítése csapvízzel történhet. Az antibiotikum meghatározása a fermentáció folyamán és az izolálási eljárásoknak pH 8-as húsleves-peptonos agadon történhet agardiffuziős módszerrel, lényegében a sztreptomicin meghatározásával megegyező módon. 1 E-nyinek nevezzük azon antibiotikus hatást, mely a megadott körülmények között a B. subtilis ATCC 8633 törzsön 22 mm gátlási gyűrűt ad. Természetesen mivel ezen gátlási értékek naponta ingadoznak, már a kísérlet kezdetén egy nyers koncentrált preparátumot standardként használunk és eredményeinket erre vonatkoztatjuk. A fermentáció követése szempontjából különösen jelentősége van annak, hogy az antibiotikus hatást gyorsan tudjuk meghatározni, mert az antibiotikum termelésnek éles maximuma van s pár óra múlva az aktivitás rohamosan csökken és érdekes módon ezután egy hullámzó termelési értéket figyelhettünk meg, az első maximális értéket azonban • a későbbiek folyamán sohasem érhetjük el. E gyors meghatározás úgy érhető el, hogy a kiöntött lemezeket az antibiotikum meghatározása előtt 3 óráig 37°-on előre inkubáljuk és utána hűtőben raktározzuk. A lemezek 48 óráig használhatók és az antibiotikus hatás 4—5 óra alatt leolvasható. Az antibiotikus hatású anyag a savanyúan szűrt f ermentléből' extrahálható kloroform, benzol, toluol segítségével, azonban legkedvezőbb eredmény kloroform segítségével érhető el. A kloroform óvatos bepárlása után nyert koncentrátum tovább tisztítható a hatóanyagnak , pH = 2 mellett vízben történő átrázásával, majd a pH neutrálisra való állítása után újra szerves oldószerbe való átvitellel. Hasonlóképpen a hatóanyag nagyfokú koncentrálása történhet szenes adszorpcióval és a hatóanyagnak a szénről vizes savanyú acetonnal történő lemosásával. A fenti két úton nyert anyag tovább tisztítható AI2O3 oszlopon való kromatografálással, pikrátképzéssel, majd éteres oldatból a klórhidrát leválasztásával. A hatóanyag fermentálása és kinyerése az alábbi példákban szemléltethető: 1. példa: Táptalaj összetétel: 3 % glükóz 0,5% kukoricalekvár 0,1% kazamin 0,3% nátriumklorid 0,5% kálciumkarbonát 2 % szójaliszt 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 200 ml táptalajt 30 percig 121 C°-on sterilizáltunk. A táptalajt lehűtése után ferdeagar - tenyészetről lemosott spóraszuszpenzió 1 ml-ével (ÍO4

spóra) rázógépre helyeztük 28°-os termosztát szobában. A rázógép 280-as fordulatot tesz percenként 2 cm kör 0 mellett. Kapott termelési érték 1950 E/ml. 2. példa: Termelés kísérleti üzemi levegőztetett fermentorban. Az inokulum és fermentor táptalaj összetétele ugyanaz, mint az 1. példában. Spóraszuszpenzióval oltunk az 1. példában megadott módon 10 rázótenyészetet, melyet 24 óra múlva steril körülmények között egy oltóedénybe szívunk össze és ezzel oltunk 40 liter hasznos térfogatú inokulum fermentort, melynek sterilizálása 30 percig 121°-on történt keverés közben, direktgőz bevezetésével. A rázótenyészetekben előcsírázott spóra az inokulum fermentorban 28 óra alatt be-