148962. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid jellegű (KI 79 jelzésű) antibiotikum előállítására

2 148.962 levegőmicélium színe szürke, rózsaszínes árnyalattal, erős szürkés oldódó pigmentet termel (28 C°). Egyszerű zselatin: szúrási tenyészetben mérsékelten folyósít, oldódó pigmentet nem termel (20— 22 C°). Húsleves zselatin: szúrási tenyészetben nem folyósít, oldódó pigmentet nem termel (20—22 C°). Nitrátredukció: nem redukál (28 C°). Haemolízis: nem ' hemolizál (28 C°). D-tartarát-ot nem erjeszti (28 C°). Szaccharózt, laktózt, dextrózt, mannitot, maltózt, mannózt, arabjnozt, galaktózt, laevulózt, rhamnózt, raffinózt, xilózt, trehalózt, dulcitot, inozitot, szorbitot, szorbózt, adonitot, szalicint és inulint nem erjeszti; dextrózban erős füst-szürke, arabinózban, galaktózban. laevulózban kevés oldódó pigmentet termel (peptonvíz, 28 C°). A hatóanyag termelése- nem korlátozódik a fentiekben leírt törzsekre, hanem kiterjed azok variánsaira és mutánsaira is. Az antibiotikum termelése a Streptomyces törzs süllyesztett aerob tenyésztésével történik steril körülmények között, az antibiotikumok előállítására használatos készülékekkel, így pl. a termelés történhet úgy, hogy burgonyás ferdeagaron tenyésztjük a Streptomyces törzset, a keletkező spórákat víz segítségével lemossuk és a kapott spóraszuszpenzióval beoltjuk az 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 200 ml steril és megfelelő összetételű táptalajt. Az Erlenmeyer-lombikot 28 C°-on termosztát szobában levő rázógépre helyezzük. A fermentáció 80—130 óráig tart, de eljárhatunk úgy is, hogy az antibiotikum iparban használatos „többlépcsős tenyésztési módszert" használjuk. A s.póraszuszpenzióval beoltott 6 óráig rázatott tenyészetekkel 100 liter hasznos térfogatból a megfelelő összetételű steril táptalajt tartalmazó inokulum fermentort oltunk és 48 óráig 28 C°-on levegőztetve és keverve folytatjuk a tenyésztést, majd ezzel oltunk 1000 literes hasznos térfogatból és ugyancsak megfelelő steril táptalajt tartalmazó fermentort. A tenyésztést 80—130 óráig folytatjuk keverés és levegőztetés közben. A táptalaj tartalmaz nitrogénforrásként szójalisztet, amerikai mogyoró-lisztet, kukoricalekvárt, élesztőt, peptont, kazeint, energiaforrásként glükózt, keményítőt, szaccharózt, laktózt és glicerint, továbbá anorganikus sókat a növekedés elősegítésére és a táptalaj pH-jának állandósítására. A habzás megakadályozása olaj segítségével történik. A legmegfelelőbb táptalaj az antibiotikum termelésre 2% szójaliszt, 3% laktóz, 0,3% glükóz, 0,5 kukoricalekvár (50% szárazanyagra számítva), 0,1% kazamin, 0,3% nátriumklorid, 0,5% kalciumkarbonát, 0,5% pálmaolaj. pH sterilezés után 7-es, a táptalaj készítése csapvízzel történik. Az ismertetendő kísérletek eredményei mesterségesen megválasztott egységekkel történik. Az antibiotikum hatás mérését agardiffuziós módszerrel pH 7,2-es agáron végeztük, melyet staphylococcus aureus P 202 törzssel fertőztük. 1 E-nek vesszük azon antibiotikus hatást, mely a megadott körülmények között 20 mm-es gátlási gyűrűt ad. Természetesen, mivel ezen gátlási érték naponta ingadozik, már a kísérletek kezdetén egy nyers koncentrált preparátumot használtunk standardként eredményeink állandósítására. A törzs által termelt antibiotikum jól oldódik butanolban, benzolban, etilacetátbain. A hatóanyag kedvező megoszlási hányadosa folytán egyszeri kikeverés után a szerves fázisba megy át. A butanol leválasztása, esetleges nátriumszulfáton történő szárítása után a butanol t besűrítjük az eredeti térfogat 1/15, 1/25 részére. A besűrítési .maradékhoz addig adunk étert, amíg az kiválást okoz. A kivált csapadékot állni hagyjuk, majd szűrjük. Az így nyert nyers, por 200—200 E/mg aktivitást mutat. Az. éter butanolos anyalúg bepárlásával további, sokkal kisebb aktivitású anyag nyerhető. Célszerűbb azonban úgy eljárni, hogy az anyalúghoz alkoholos kálilúgot adunk mindaddig, amíg ennek hatására kiválás tapasztalható. Az így keletkezett anyag jobb vízoldhatóságot mutat mint az első csapadék. Mivel a K 179 jelzésű törzs által termelt hatóanyag és a szennyezései hasonló karakterű peptid jellegű vegyületek, tisztítása rendkívül nagy problémát okoz. Fokozza a nehézséget az, hogy a kísérő anyagok oldhatósági viszonyai fermentációnként változnak. Különösen jelentős differencia tapasztalható a széntetrakloridban való oldhatóság szempontjából. A fermentálás és feldolgozás kivitelezését az alábbi példákon szemléltethetjük. 1. példa: Táptalaj összetétele: 2 % szójaliszt 3 % laktóz 0,3% glükóz. 0,5% kukoricalekvár (50%-os szárazanyagtartalomra számolva) 0,1% kazamin 0,3% nátriumklorid 0,5% kálciumkarbonát 0,5% pálmaolaj. 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 200 ml táptalajt 30 percig 121 C°-on sterilizáltunk. A táptalajt lehűtése után ferdeagar tenyészetről lemosott spóraszuszpenzió 1 ml-ével oltva (104

spóra) rázógépre helyeztük 28 C°-os termosztát szobában. A rázógép 280-as fordulatot tesz percenként 2 cm kör 0 mellett. Kapott termelési érték 350 E/ml. 2. példa: Termelés kísérleti üzemi levegőztetett fermentorban. Az inokulum táptalaj összetétele a következő volt: 2 % szójaliszt 3 % glükóz 0,1% laktóz. 0,5% kukoricalekvár (50%-os szárazanyagtartalomra számolva) 0,1% kazamin 0,3% nátriumklorid