148962. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid jellegű (KI 79 jelzésű) antibiotikum előállítására

148.962 0,5% kálciumkarbonát 0,5% pálmaolaj. Fenti táptalajt az 1. példában megadott módon sterilizáltuk és az oltást is hasonló módon végeztük el. A rázott tenyészeteket ©0 órás korukban steril körülmények között egy oltóedénybe szívattuk és ezzel oltottunk 100 literes hasznos térfogatú inokulum fermentort, melynek sterilizálása 30 percig 121 °-on történt keverés közben direktgőz bevezetésével Ezen inokulum fermentor táptalaja megegyezett a rázó inokulum táptalaj összetételével. Az anyagot 250-es fordulatú turbokeverővel kevertük és 1 térf. levegővel levegőztettük. A tenyészetet 40 órás korában az 1. példában megadott fermentációs táptalajba oltottuk, mely egy 1000 literes fermentorban volt. Az ÍOO'O literes fermentor kezelése megegyezett az inokulumtank kezelésével. A termelt antibiotikum mennyiség a fermentáció 76. órájában 256 E/ml. A fermentlevet 30 percig 40—50 C° között tartottuk, ami a szűrési időt lerövidítette és a micélium térfogatát csökkentette. 900 liter fermentlevet kaptunk, melynek az aktivitása 216 E/ml, melyet 180 liter butanollal kikevertettünk. A leválasztott butanol aktivitása 7O0 E/ml. A kiextrahált fermentlé 13 E/ml aktivitást tartalmaz. A butanolt óvatosan csökkentett nyomáson 3 literre bepároltuk, maj 20 liter étert hozzáadva a hatóanyagot kicsaptuk. Éteres mosás és szárítás után 250 g 220 E/mg aktivitású port kaptunk. A szűrési anyalúghoz alkoholos kálilúgot adva, 100 g súlyú, 180 E/mg aktivitású szilárd anyag válik ki. Az anyag további tisztítása a peptid jellegű vegyületek tisztítására alkalmas módszerekkel történhet. így eredményesen használható az ellenáramú megoszlás módszere. Mivel azonban a kísérő szennyezések jellege változik, ezen tisztítási eljárás hatásfoka nagyon változó. Egyes esetekben 80%-os vizes etanol-CClzrpetroléter (3 : 1) között 1 megoszlási érték nyerhető, ami az ellenáramú megoszlás kivitelezését könnyen lehetővé tette. A hatóanyag papírkromatográfiai futtatása vizes sósavval telített víz-izopropanol-CCU rendszerben végezhető el, amely esetben a papíron B. subtilisszel kiöntött agar lemezen két gátlási gyűrű figyelhető meg, ami két komponens jelenlétére mutat. Az anyag további tisztítása során vizes frakcionált kioldással, aktív szénen való megkötéssel és frakcionált leoldással 350 E/mg hatóanyagtartalmú tisztított termékig sikerült eljutnunk. Az anyag ninhidrinnel nem reagál, csak sósavas hidrolízis után. A savas hidrolízis termékei papíron futtatva 5 ninhidrinnel előhívható foltot adnak. Az anyag elementáranalízise az alábbiakban adható meg: C = 59,81%, H = 6,69%, N = = 9,60%, hamu = 3,1%. Az anyag ultraibolya spektruma 0,1 n HCl-ben 304 m/x-nál mutat maximumot, amely maximum 0,1 n NaOH-ban 334 m/x-ra tolódik el. Az anyag mikrobiológiai hatása a következő táblázat adataival jellemezhető. K 179 teljes gátlás bouillonban, illetve pepton vízben 24 óráig, törzs: E/ml* Staphylococcus' 0,6—0,15 Staphylococcus" 0,6 Subtilis 0,15—< 0,3—< 0,6 Typhus 31 — >75 Paratyphus A >150 Paratyphus B > 75 Sh. Felxner > 19 Klebsiella > 150 Proteus 125 Coli, 0 : 111 15 Pyocyaneus 250 Mycobact. Pellegrino 0,3 ? Mycobact. Smegmatis 0,3 ? * A magasabb antibiotikum koncentrációjú csövek zavarosak, a növekedés nehezen ítélhető meg. Az anyag LD50 értéke intravénás adagolásban 100 mg/testsúlykg. A K 179 jelzésű törzs által termelt anyag ezen tulajdonságai alapján az irodalomban Etamycin és Viridogrisein neveken leírt egymással azonos antibiotikumokhoz mutatott nagy hasonlóságot. (J. Am. Chem. Soc. 80, 3349, 1958; J. Chem Soc. 1958. 4466; Antibiotics Anual 2, 228, 777, 784, 1954—55.) Ezért külföldről szerzett Viridogrisein minta aktivitását megmértük és azt 210 E/mg-nak találtuk akkor, amikor mi 350 E/mg aktivitású anyagot állítottunk elő a KI 79 jelzésű törzs által termelt anyagból. így a KI 79 antibiotikus hatású anyaga nagyon hasonlít a Viridogriseinhez, de azzal nem egyezik meg. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás peptid jellegű antibiotikum kinyerésére, melyre jellemző, hogy a K 179 jelzésű törzset (letétbe helyezve az Országos Közegészségügyi Intézetnél 60/205.4. sz. alatt), valamint mutánsait és variánsait szénhidrát, fehérje, ásványi só tartalmú táptalajion. 24—30 C° között kevertetés és levegőztetés mellett tenyésztjük és a fermentáció 60—120. órájában a neutrálisán szűrt fermentléből a hatóanyagot elkülönítjük. 2. Az 1. alatti igénypontban meghatározott eljárás, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot vízzel nem keveredő oldószerrel, célszerűen butanollal, benzollal vagy etilacetáttal való kikeveréssel nyerjük ki, majd ennek koncentrátumából éter hozzáadására a port leválasztjuk. 3. A 2. igénypontban meghatározott eljárás továbbfejlesztése, melyre jellemző, hogy az anyalúgból a bennemáradt aktív anyagot alkoholos KOH hozzáadásával csapjuk ki. A kiadásért telel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 614874. Terr Nyomda, Budapest V., Balassi Bálint utca 21-23.