146469. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12 vitamint és rokonvegyületeit tartalmazó fermentációs termékek feltárására

2 148.469 költséges berendezést is igényel, a B12 vitamingyártás nagyvolumenű fázisában ne kelljen alkalmazni, megvizsgáltuk az ismert reagensek hatásfokát a feltárásban, a ciánnal összehasonlítva. Kísérleti anyagunk alkoholos táptalajon fenntartott, methanobaktériumos fermentáció terméke volt. Megjegyezzük, hogy különböző eredetű fermentációs termékek B12 vitamin tartalmának feltárása, egy adott reagenssel, nem történik szükségképpen egyforma hatásfokkal, azaz egyes termékek könynyebben, mások nehezebben tárhatók fel. Tapasztalatunk szerint a methanobaktériumos fermentáció terméke a nehezebben feltárható anyagok közé tartozik, ezért választottuk ezt kiindulási anyagnak. A fermentlétaen lebegő baktériumtesteket Al2(SC>4)3 oldat hozzáadásával koaguláltattuk és az így nyert üledéket használtuk a feltárási kísérletekhez. Megvizsgáltuk a cián-, szulfit- és nitritionok hatását és mint felületaktív anyagot, a zsíralkohol szulfonátot is. Megvizsgáltuk azonkívül a thioglikolsav hatását is, amit ugyan feltáróreagensként nem alkalmaznak, de amiről ismeretes, hogy kis koncentrációjú B12 oldatok hőkezelésénél stabilizáló hatású. A nyert eredményeket az I. táblázatban közöljük. Látható, hogy a kétszer, reagens nélkül kifőzött anyagból kapott nyeredék csak tob. fele a ciánnal feltárt anyag nyeredékének. Az irodalomból ismert SO"2 és No'

2

ionok feltáró hatása kétségtelenül megállapítható, de az adott mennyiségben alkalmazva a cián effektusát még nem érik el. A zsíralkoholszulfonátnak semmi hatása nincs, de a tioglikolsavval elérhető ugyanaz a nyeredék, mint a ciánnal. Ez utóbbi megállapításnak elsősorban elvi jelentősége van, mert a tioglikolsav drága a nagyipari alkalmazásra. A 2 vegyértékű ként tartalmazó anyagokat (Na-szulfid, thioszulfát, dithionit, cystin stb.) tovább vizsgálva megállapítottuk, hogy valamenynyinek van több-4íevasebb feltáró hatása és ezek közt a dithionit mutatkozott különösen alkalmasnak. Meglepő volt azonban az a kísérleti eredmény, ami a további vizsgálatok során azt mutatta, hogy .Hogy az egyes reagensek effektusát biztosabban meg tudjuk állapítani, ebben az előkísérletben úgy jártunk el, hogy a feldolgozásra szánt 1800 g üledéket előbb minden reagens hozzáadása nélkül csak vízzel elkeverve és sósavval pH 5,5-re beállítva, felforraltuk, majd lehűlés után a folyadékot centrifugálással leválasztottuk. Az így 'vízzel kifőzött anyag súlyát víz hozzáadásával ismét 1800 g-ra állítottuk be, majd 6 egyenlő részre osztva, a táblázat szerinti reagensek hozzáadásával felforraltuk és 5 perc forralás után lehűtve centrifugáltuk. A teljes mennyiség első vizes f őze tét, melynek térfogata 2030 ml volt, és a 6 feltárási kísérlet főzeteit lúggal pH 8-ra állítottuk, a keletkezett inert csapadékot centrifugálással elkülönítettük és a tiszta szupernatanst pH 5-re visszasavanyítva kimerítően kiextraháltuk 1:2 térfogatarányú fenolkloroformimal, majd az összegyűjtött és vízzel kimosott oldószeres fázisból a hatóanyagot éterrel vízbe átszorítottuk. Az így nyert vizes sűrítményből sec. butacol-ciários víz szolvenssel végzett papírkromatográfiával választottuk el a tiszta B12 vitamint, — amit a papírból kioldva fotométerrel B12 standardhoz viszonyítva megmértünk. az eddig ismert, valamint az általunk vizsgált raegenseken kívül —• amelyek valamennyien redukáló tulajdonságúak —, erős oxidálószerek hozzáadásával is igen jó hatásfokú feltárást lehet elérni, a feltáródott B[2

vitamin bomlása nélkül. Ilyen feltáró effektust találtunk a KMnÜ4 és K2CrÜ4 használata esetén, legalkalmasabbnak találtuk a krómsavanhidridet. Ezeknek a reagenseknek külön előnye, hogy az alkalmazott igen kevés, kb. 1/2 ezreléknyi mennyiségek nemcsak a feltáródást segítik elő, hanem a feltárt anyag szűrhetőségét is nagymértékben megjavítják és tisztább szűrletet eredményeznek. Abból a megfigyelésiből, hogy úgy a redukáló, mint az oxidáló hatású anyagokkal elő lehet segíteni a feltárást, arra lehet következtetni, hogy a közegben lejátszódó redox reakciónak lehet szerepe. Ezért (megpróbáltuk az önmagukban is hatásosnak talált oxidáló és redukáló reagenseket együttesen is alkalmazni. I. sz. lablazat Az első, kö; zös, vizes kifőzés terméke •: 1240 gí imma B12 vitamin Ennek része 1/6--od 207 gamma B12 207 gamma • B12 207 gamma B,2 207 gamma B12 207 gamma B12 207 gamma B12 Feltáró reagens NaCN 50 mg NaHS03 150 mg NaN02 150 mg zsíralk. szulf. 150 mg thioglikolsav 0,2 ml 0 A reagenssel kinyert B12 ,304 gamma 183 gamma 196 gamma 71 gamma 300 gamma 77 gamma ÖSSZ, B12 nyeredék 511 gamma 390 gamma 403 gamma 278 gamma 507 gamma 284 gamma Kitermelés a CN-hoz viszonyítva 100% 76,50/o 79% 54,5o/0 99,5% 55,6o/0